Uso de óleos essenciais e extrato de própolis no controle de fungos micotoxigênicos associados a feijão-caupi

Use of essential oils and propolis extract on the control of mycotoxigenic fungi associated with cowpea beans

RESUMO

Objetivou-se avaliar o efeito in vitro e in vivo de diferentes concentrações de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial de citronela e óleo essencial de capim-limão sobre isolados de Aspergillus associados a grãos de feijão-caupi. Foram utilizados, quatros isolados de Aspergillus sendo: LPPC 104 e LPPC 122 (Aspergillus niger), LPPC 113 (Aspergillus tamarii) e LPPC 130 (Aspergillus sp.). No ensaio in vitro foram testadas as concentrações de 0,0, 15,62, 31,25, 62,50, 125 µL/L para o eugenol e 0, 25, 50, 75, e 125 µL/L para extrato de própolis, OE de citronela e OE de capim-limão. Foram preparadas suspensões de conídios na concentração de 10⁵ conídios/mL para cada isolado de Aspergillus. Foram mensuradas as quantidades de unidades formadoras de colônias e porcentagem de germinação de esporos a cada 24 h. O controle correspondeu a deposição de suspensão fúngica em meio BDA sem a presença dos compostos utilizados. No teste in vivo 200 grãos de feijão-caupi foram imersos por 3 minutos em soluções de eugenol, extrato de própolis, OE de citronela, OE de capim-limão e a testemunha (água) e incubadas de acordo com metodologia do papel de filtro. Após oito dias de incubação avaliou-se a frequencia de fungos associados aos grãos. Os resultados indicam que todos os compostos testados apresentam atividade fungitóxica e que o OE de capim-limão foi mais eficiente tanto nos teste in vitro como in vivo para isolados de Aspergillus e pode ser uma alternativa para o tratamentos de fungos associados aos grãos de feijão-caupi.

Palavras-chave
Aspergillus tamarii ; micotoxinas; Vigna unguiculata

ABSTRACT

The objective of the present study was to assess the in vitro and in vivo effects of different concentrations of eugenol, propolis extract, citronella essential oil and lemongrass essential oil on Aspergillus isolates associated with cowpea grains. Four Aspergillus isolates were used: LPPC 104 and LPPC 122 (Aspergillus niger), LPPC 113 (Aspergillus tamarii), and LPPC 130 (Aspergillus sp.). In the in vitro assay, concentrations of 0.0, 15.62, 31.25, 62.50, and 125 µL/L were tested for eugenol, while 0, 25, 50, 75, and 125 µL/L were tested for propolis extract, citronella essential oil and lemongrass essential oil. Conidial suspensions were prepared at a concentration of 10⁵ conidia/mL for each Aspergillus isolate. The number of colony-forming units and spore germination percentage were measured every 24 hours. The control corresponded to depositing fungal suspension on PDA medium without the tested compounds. In the in vivo test, 200 cowpea grains were immersed for 3 minutes in solutions of eugenol, propolis extract, citronella essential oil, lemongrass essential oil and the control (water), and subsequently incubated according to the filter paper methodology. After eight days of incubation, the frequency of fungi associated with the grains was evaluated. Results indicate that all tested compounds exhibit fungitoxic activity and lemongrass essential oil is most efficient both in vitro and in vivo against Aspergillus isolates, constituting a feasible alternative for treating fungi associated with cowpea grains.

Keywords
Aspergillus tamarii ; mycotoxins; Vigna unguiculata

Os fungos desempenham um papel preponderante como contaminantes alimentares, resultando em significativas perdas na indústria alimentícia e impactando globalmente a produção de alimentos. Eles têm a capacidade de induzir o aquecimento dos grãos, a redução de massa e a depreciação do valor nutricional (⁹). Ademais, a presença de fungos toxigênicos e micotoxinas em grãos figura como uma das preocupações mais relevantes nas esferas social e econômica, especialmente nos países produtores de cereais e leguminosas (¹⁴).

Para além dos danos gerais provocados por fungos nos grãos, algumas espécies têm a capacidade de sintetizar micotoxinas. Essas substâncias tóxicas são produzidas por determinadas espécies de fungos que proliferam em grãos e alimentos quando submetidos a condições inseguras, sobretudo em ambientes de alta umidade. As micotoxinas apresentam um potencial significativo de acarretar implicações sérias tanto na saúde humana quanto animal. Em resposta a essa problemática, diversas medidas de gerenciamento têm sido objeto de pesquisa com o intuito de mitigar o risco de disseminação de alimentos contaminados por micotoxinas ao longo das cadeias de processamento de grãos e alimentos destinados à alimentação (⁵, ⁹).

Um dos principais gêneros associados com a produção de micotoxinas é o gênero Aspergillus. Sabe-se que algumas espécies desse gênero são produtores de micotoxinas como A. niger Tieghem, A. ochraceus Wilhelm, A. carbonarius (Bainier), A. flavus Link, A. parasiticus Speare e A. nomius Kurtzman, são sabidamente produtores de aflatoxinas, ácido ciclopiazônico (CPA), ocratoxinas e patulina (¹⁴).

Uma pluralidade de abordagens tem sido empregada para controlar fungos toxigênicos e micotoxinas em grãos e seus derivados. Entre elas, destacam-se métodos físicos, biológicos e químicos (²⁷, ²⁸). Em termos de métodos físicos, merecem destaque a limpeza dos grãos, a irradiação por micro-ondas e a ionização (¹⁷). Já em relação aos métodos químicos e biológicos, ganham relevância a ozonização e a incorporação de microrganismos antagônicos como as bactérias lácteas, bem como o fungo do gênero Trichoderma (¹⁵, ¹⁸). Uma alternativa que vem sendo amplamente investigada, com respostas promissoras, consiste na utilização de extratos de plantas ou óleos essenciais para conter a proliferação de fungos associados aos grãos.

Os óleos essenciais, constituídos por compostos orgânicos voláteis que conferem a fragrância característica a várias plantas, têm demonstrado relevância marcante em determinadas investigações, dada a sua potencial aplicabilidade no contexto fitossanitário. Seu uso vem propiciando o desenvolvimento de técnicas que mitigam os efeitos adversos ocasionados por agentes oxidantes, radicais livres e microrganismos, que resultam em prejuízos substanciais nas indústrias alimentícias e agrícolas (²). Notavelmente, estes compostos, são classificados como GRAS (Geralmente Reconhecido Como Seguro) pela Food and Drug Administration (¹¹). O termo GRAS, cunhado pela Food and Drug Administration (FDA), designa um componente químico ou substância adicionada a alimentos, que especialistas consideram seguro, dispensando, assim, as exigências de tolerância aplicáveis a aditivos alimentares (¹⁹).

Os óleos essenciais vêm sendo alvo de estudos que avaliam sua atividade biológica e antimicrobiana, incluindo seu efeito deletério sobre fitopatógenos (¹², ²¹). O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos in vitro e in vivo de diferentes concentrações de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial de citronela e óleo essencial de capim-limão sobre isolados de Aspergillus associados a grãos de feijão-caupi.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolados de Aspergillus utilizados

No âmbito do presente estudo, foram empregados quatro isolados de Aspergillus, a saber: LPPC 104 e LPPC 122 (Aspergillus niger sensu stricto), LPPC 113 (Aspergillus tamarii) e LPPC 130 (Aspergillus sp.). A identificação prévia destes isolados ocorreu por meio da análise da região gênica β-tubulina. Os isolados estão depositados na coleção do Laboratório de Patologia pós-colheita da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife.

Efeito de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial de citronela e de capim-limão sobre Aspergillus spp.

Para avaliar o efeito de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial (OE) de citronela e OE de capim-limão no crescimento de Aspergillus spp, foram preparadas suspensões de conídios na concentração de 10⁵ conídios/mL para cada isolado de Aspergillus. Uma alíquota de 0,2 mL desta suspensão foi depositada em placas de Petri contendo o meio de cultura BDA, enriquecido com eugenol, extrato de própolis, OE de citronela ou OE de capim-limão. Utilizando uma alça de Drigalski, a suspensão foi uniformemente espalhada na superfície do meio, e as placas foram incubadas à 25°±2°C, com fotoperíodo de 12 h claro/12 h escuro.

Foram testadas as concentrações de 0,0 (testemunha), 15,62, 31,25, 62,50, 125 µL/L para o eugenol (²⁵) e 0, 25, 50, 75, e 125 µL/L para extrato de própolis, citronela e OE de capim-limão (³). A cada 24 horas, a quantidade de unidades formadoras de colônia foi mensurada. O controle consistiu na aplicação da suspensão fúngica em meio BDA sem a incorporação dos compostos em estudo.

O experimento in vitro foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 4 + 1 (4 isolados x 4 concentrações + testemunha), com 8 repetições para cada tratamento, sendo que cada repetição correspondia a uma placa de Petri. Os dados obtidos nesse estudo foram submetidos à análise de variância, além disso, foram realizadas análises de regressão para dados quantitativos.

Adicionalmente, avaliou-se o efeito das concentrações de eugenol, extrato de própolis, citronela e OE de capim-limão na germinação dos conídios de Aspergillus. Em tubos de ensaio contendo água destilada esterilizada (ADE) foi adicionada uma suspensão de conídios a 10⁵ conídios/mL, juntamente com o composto em questão, de acordo com as mesmas concentrações utilizadas no experimento anterior, com a adição de Tween 80 a 1%. As avaliações foram realizadas determinando-se a porcentagem de germinação de 100 conídios por amostra, 24 horas após o início da incubação, contando-se o número de esporos germinados e não germinados em câmara de Newbauer. Foram considerados esporos germinados aqueles que apresentaram tubo germinativo como tamanho igual ou superior aos conídios.

Efeito de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial de citronela e de capim-limão na sanidade de grãos de feijão-caupi

Foi avaliado o efeito de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial (OE) de citronela e OE de capim-limão na sanidade de grãos de feijão-caupi. Grãos de feijão-caupi foram desinfestados em hiploclorito de sódio a 1% durante 3 minutos, e em seguida secos a temperatura ambiente. Em seguida, esses grãos foram imersos em soluções de eugenol, extrato de propolis, OE de citronela e OE de capim-limão (nas mesmas concentrações do ensaio in vitro), mantidos em agitação por 3 min, seguido de um período de repouso durante a noite. No dia subsequente, os grãos foram depositados em caixas do tipo gerbox, contendo três folhas de papel de filtro embebidas em ADE. As caixas gerbox, com os grãos, foram incubadas por sete dias à 20±2 °C em fotoperíodo de 12 horas. Os grãos foram examinados individualmente, com o auxílio de estereomicroscópio e de microscópio ótico para a presença de estruturas fúngicas. Um total de 200 grãos de feijão-caupi foi utilizado para cada tratamento.

A frequência dos fungos associados aos grãos de feijão-caupi, submetidos às diferentes concentrações de eugenol, extrato de própolis, OE de citronela e OE de capim-limão, foi calculada. A testemunha foi constituída de grãos sem a adição dos compostos citados. Foram conduzidas análises de regressão, adotando-se como critérios para a escolha do modelo, o maior coeficiente de determinação ajustado e a significância dos coeficientes da regressão testados pelo teste F a 1% de probabilidade. As análises estatísticas foram conduzidas utilizando o programa Sisvar (⁸).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Efeito de de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial de citronela e de capim-limão em Aspergillus spp.

Ao analisar os dados relativos ao efeito in vitro de distintas concentrações de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial (OE) de citronela e óleo essencial (OE) de capim-limão, constatou-se que todos os compostos mencionados reduziram de maneira significativa as variáveis de unidade formadora de colônia (UFC) e porcentagem de germinação como demonstrado na Figura 1. Isso ocorreu em comparação com o grupo de controle, à medida que as concentrações aumentavam. Apesar de haver relatos sobre a atividade fungitóxica de diversos óleos essenciais contra uma ampla gama de microrganismos, pouco se conhece sobre os mecanismos subjacentes a essa ação. Segundo Kumar et al. (¹⁶), as atividades dos óleos essenciais e seus componentes estão intrinsecamente ligadas às suas propriedades hidrofóbicas. Isso os capacita a interagir com a camada lipídica das membranas celulares, resultando em modificações estruturais que reduzem sua seletividade. Consequentemente, ocorre vazamento de íons e outros componentes celulares.

No caso das diferentes concentrações de eugenol, observou-se uma diminuição na unidade formadora de colônias à medida que as concentrações testadas aumentavam, como ilustrado na Figura 1 . Resultado semelhante foi evidenciado na porcentagem de germinação. O incremento das concentrações de eugenol ocasionou uma redução na porcentagem de germinação de diversos isolados de Aspergillus, conforme mostrado na Figura 1A.

Figura 1
Análise de regressão do efeito in vitro de diferentes concentrações de eugenol, extrato de própolis, OE de citronela e OE de capim-limão sobre isolados de Aspergillus. (IA) UFC de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de eugenol. (IB) UFC de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de extrato de própolis. (1C) UFC de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de OE de citronela (ID) UFC de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de OE de capim-limão. Aspergillus niger sensu stricto (LPPC 104, LPPC 122) Aspergillus tamarii (LPPC 113) e Aspergillus sp. (LPPC 130).

Em uma investigação realizada por Silva (²⁴), foi documentada a inibição do crescimento micelial do fungo Rhizopus stolonifer, um importante patógeno pós-colheita. Isso ocorreu em meio de cultura contendo óleo essencial do cravo-da-índia, em concentrações de 200, 400, 600 e 800 mg/mL. A atividade antifúngica do óleo essencial está intrinsecamente relacionada à sua hidrofobicidade, o que lhe permite interagir com os lipídios presentes na parede celular, membrana celular e mitocôndrias. Essa interação leva a alterações na permeabilidade, ocasionando distúrbios nessas estruturas

As ações fungitóxicas do extrato de própolis sobre a unidade formadora de colônias (UFC) de distintos isolados de Aspergillus encontram-se ilustradas na Figura 1B. Conforme as análises estatísticas de regressão, observou-se que as concentrações do extrato de própolis desencadearam respostas lineares, quadráticas e exponenciais nos diversos isolados, tanto para a variável unidade formadora de colônias quanto para a porcentagem de germinação (Figura 2). Isso evidencia a sensibilidade dos isolados frente a diferentes concentrações do extrato de própolis, como demonstrado na Figura 2B.

Figura 2
Análise de regressão do efeito in vitro de diferentes concentrações de eugenol, extrato de própolis, OE de citronela e OE de capim-limão sobre isolados de Aspergillus. (2A) Porcentagem de germinação de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de eugenol. (B) Porcentagem de germinação de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de extrato de própolis. (C) Porcentagem de germinação de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de OE de citronela. (D) Porcentagem de germinação de isolados de Aspergillus expostos a diferentes concentrações de OE de capim-limão. Aspergillus niger sensu stricto (LPPC 104, LPPC 122) Aspergillus tamarii (LPPC 113) e Aspergillus sp. (LPPC 130).

Ao longo dos últimos anos, têm-se efetuado estudos que atestam as propriedades antimicrobianas da própolis. Nota-se sua eficácia contra o Staphylococcus aureus (⁷), Streptococcus pyogenes (⁴), Candida sp. (²⁵), Aspergillus flavus (⁶) e a Cercospora coffeicola (²⁰, ²²). Tais resultados reforçam as constatações deste estudo, evidenciando o notável potencial antimicrobiano da própolis.

Segundo Fontana et al. (¹⁰), a ação fungicida e fungistática da própolis é majoritariamente atribuída aos ácidos aromáticos e seus derivados, bem como aos flavonoides. Esses compostos fitoquímicos possuem a habilidade de inibir a síntese de DNA e comprometer a integridade da membrana plasmática dos fungos (²⁴).

O efeito de diferentes concentrações do OE de citronela sobre isolados de Aspergillus é apresentado na Figura 2. Foi observado um comportamento diversificado dos isolados em resposta às diferentes concentrações de citronela testadas. O isolado LPPC 130 (Aspergillus sp.) demostrou maior sensibilidade em relação à variável unidade formadora de colônia, em comparação com outros isolados utilizados no estudo. Houve uma diminuição na porcentagem de conídios germinados, dos isolados avaliados neste estudo, à medida que a concentração do OE aumentava, conforme pode ser visualizado na Figura 2C. Para o isolado 122 (Aspergillus niger sensu stricto) ocorreu uma diminuição de até 30% na maior concentração testada, evidenciando a sensibilidade desse isolado ao composto.

No tocante ao OE de citronela, vários estudos têm evidenciado o potencial antimicrobiano desse óleo. Perini et al. (²³), observaram inibição total do crescimento in vitro de Pyricularia grisea sob diferentes alíquotas (30, 60, 90, 120 e 150 µL) do óleo essencial de citronela. Neste trabalho o OE de citronela se destacou pela redução de fungos associados aos grãos de feijão-caupi, com uma frequência de 40%, comparada com a testemunha que obteve 88% dos grãos de feijão-caupi com a presença de fungos.

O óleo essencial de capim-limão teve seu efeito in vitro testado sobre diferentes isolados de Aspergillus. Pode-se observar uma diminuição nos valores de unidade formadora de côlonia e germinação de conídios quando comparados com a testemunha, através da utilização do OE de capim-limão nos isolados de Aspergillus. Também se constatou uma variação na porcentagem de germinação de todos os isolados testado, com destaque para o efeito no isolado LPPC 122 (Aspergillus niger sensu stricto), cuja germinação foi reduzida em ate 40% (Figura 2D).

Estudos envolvendo fungos fitopatogênicos e OE de capim-limão têm sido conduzidos com resultados extremamente promissores. O OE de capim-limão apresentou ação antifúngica contra Pseudocercospora griseola, causando danos ultraestruturais nas células dos conídios. Foram observadas condensações no citoplasma, fusão dos vacúolos, alterações na estrutura mitocondrial interna, lise de organelas membranosas, ruptura da membrana plasmática e da parede celular (¹³).

Tzartzakis et al. (²⁷) avaliaram a atividade antifúngica do OE de capim-limão contra Colletotrichum coccodes, Botrytis cinerea, Cladosporium herbarum, Rhizopus stolonifer e Aspergillus niger, importantes patógenos em pós-colheita em frutas, por meio do teste de difusão em ágar. Os autores observaram efeito na germinação de esporos, crescimento do tubo germinativo e micelial em todos os fungos testados.

Efeito de eugenol, extrato de própolis, óleo essencial de citronela e de capim limão na sanidade de grãos de feijão-caupi

Foi constatada a redução da presença de fungos associados aos grãos de feijão-caupi quando tratados com diferentes concentrações de eugenol, extrato de própolis, OE de citronela e OE de capim-limão, em comparação com a testemunha como visualizado na Figura 3. De acordo com os resultados obtidos, o eugenol reduziu a frequência de fungos associados a feijão-caupi em ate 50%, em comparação com a testemunha, destacando o potencial desse composto para o tratamento de grãos de feijão-caupi. Quanto ao extrato de própolis, da redução da frequência de fungos foi de até 47%, em comparação com a testemunha.

Figura 3
Análise de regressão do efeito in vivo de diferentes concentrações de eugenol, extrato de própolis, OE de citronela e OE de capim-limão sobre a frequência de fungos associados aos grãos de feijão-caupi. (A) Frequência de fungos associados aos grãos de feijão-caupi expostos a diferentes concentrações de eugenol. (B) Frequência de fungos associados aos grãos de feijão-caupi expostos a diferentes concentrações de extrato de própolis. (C) Frequência de fungos associados aos grãos de feijão-caupi expostos a diferentes concentrações do OE de citronela. (D) Frequência de fungos associados aos grãos de feijão-caupi expostos a diferentes concentrações do OE de capim-limão.

A aplicação dos óleos essenciais de citronela e capim-limão também reduziram a frequência de fungos associadas a grãos de feijão-caupi em 40% e 42%, respectivamente, quando comparado com a testemunha. Nossos resultados, evidenciam o potencial de utilização do eugenol, extrato de própolis, óleo essencial de citronela e óleo essencial de capim-limão no tratamento de grãos de feijão-caupi infestados naturalmente por fungos.

Em um estudo conduzido por Baiotto et al. (¹) avaliando o efeito dos óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis) e eucalipto (Corymbia citriodora) no contra fungos fitopatogênicos em grãos de soja armazenadas, contatou-se que o óleo essencial de C. citriodora reduziu a incidência de Aspergillus sp.

Apesar de extratos vegetais e óleos essenciais ter mostrado atividade antimicrobiana contra um ampla gama de fitopatógenos, estudos sobre seu uso no tratamento de grãos e sementes ainda são escassos (¹⁹, ²⁶). De acordo com o nosso conhecimento este é o primeiro estudo com o uso de eugenol, extrato de própolis, OE de citronela e OE de capim-limão no controle de Aspergillus spp. associados a grãos de feijão-caupi.

Conclui-se que, o eugenol, o extrato de própolis, o óleo essencial (OE) de citronela e o óleo essencial (OE) de capim-limão possuem efeito in vitro e na redução da ocorrência de fungos micotoxigênicos associadas aos grãos de feijão-caupi. Os compostos examinados nesta pesquisa constituem uma alternativa para o tratamento dos grãos de feijão-caupi; no entanto, será necessário conduzir mais estudos com o propósito de validar a aplicação destas substâncias para o manejo de fungos nos grãos de feijão-caupi.

AGRADECIMENTOS

Os autores expressam sua gratidão à Universidade Federal Rural de Pernambuco, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) pelo apoio financeiro e de infraestrutura fornecido.

• Paz Filho, E.R.; Machado, A.R.; Souza-Motta, C.M.; Gomes, A.A.M. Uso de óleos essenciais e extrato de própolis no controle de fungos micotoxigênicos associados a feijão-caupi. Summa Phytopathologica, v.52, p.1-8, 2026.

Declaração de disponibilidade de dados

Os dados de pesquisa estão disponíveis no corpo do artigo.

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Editado por

• EDITOR CIENTÍFICO:
  Edson Luiz Furtado https://orcid.org/0000-0002-6924-835X

• EDITOR ASSOCIADO:
  José Otávio Machado Menten https://orcid.org/0000-0002-9644-5770

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Maio 2026
• Data do Fascículo
  2026

Histórico

• Recebido
  09 Maio 2024
• Aceito
  12 Fev 2026