Efectividad de agentes oxidantes en la inactivación del tomato brown rugose fruit virus

Effectiveness of oxidizing agents in tomato brown rugose fruit virus inactivation

Eficácia de agentes oxidantes na inativação do tomato brown rugose fruit virus

RESUMEN

El jitomate (Solanum lycopersicum L.) es un cultivo muy susceptible a plagas y enfermedades. Desde 2014, la industria del jitomate se ha enfrentado a un virus emergente denominado tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV), que se caracteriza por transmitirse de forma mecánica. Por lo tanto, el uso de productos que inactiven a este virus deben implementarse en los programas de saneamiento de los invernaderos. Los objetivos de este trabajo fueron: I) evaluar la efectividad del dióxido de cloro (ClO₂), ozono (O₃) y peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en la inactivación del ToBRFV y II) conocer el efecto que causa cada oxidante en la integridad de la partícula viral. Se empleó un diseño factorial completamente al azar con cuatro concentraciones y tres tiempos de exposición para cada oxidante. Se realizaron ensayos de confrontación directa con savia infectiva y posteriormente inoculación mecánica en Nicotiana glutinosa para contabilizar el número de lesiones locales necróticas (NLL) por hoja. Con respecto al testigo positivo, el dióxido de cloro a 40-60 mg/mL redujo significativamente el NLL en 28% (Tukey, p <0.05); el ozono a 4 mg/mL en 24.8% y peróxido de hidrógeno al 5% en un 97.2%. En microscopía electrónica de transmisión se observó fragmentación de algunas partículas de ToBRFV al ser expuestas a ClO₂ y O₃. En el caso del peróxido de hidrógeno al 5% además de fragmentación se observó una alteración estructural de la cápside. Bajo las condiciones experimentales del estudio, los productos actuaron desde el primer minuto y su efectividad dependió de la concentración aplicada.

Palabras clave
Dióxido de cloro; ozono; peróxido de hidrógeno; Nicotiana glutinosa ; microscopía electrónica de transmisión

ABSTRACT

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is a crop highly susceptible to pests and diseases. Since 2014, tomato industry has been facing an emerging virus called tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV), characterized by being transmitted mechanically. Therefore, the use of products to inactivate this virus should be implemented in greenhouse sanitation programs. The objectives of this work were: I) to evaluate the effectiveness of chlorine dioxide (ClO2), ozone (O₃) and hydrogen peroxide (H₂O₂) in the inactivation of ToBRFV and II) to know the effect of each oxidant on the viral particle integrity. A factorial experiment was conducted in a completely randomized design (CRD), with four concentrations and three times for each oxidant. Direct confrontation tests were carried out with infective sap and subsequently mechanical inoculation in Nicotiana glutinosa to count the number of necrotic local lesions (NLL) per leaf. For the positive control, chlorine dioxide at 40-60 mg/mL significantly reduced the NLL by 28% (Tukey, p <0.05); ozone at 4 mg/mL in 24.8% and hydrogen peroxide at 5% in 97.2%. In transmission electron microscopy, fragmentation of some ToBRFV particles was observed when exposed to chlorine dioxide and ozone. In 5% hydrogen peroxide, in addition to fragmentation, a structural alteration of the capsid was observed. Under the experimental conditions of the study, the products acted from the first minute and their effectiveness depended on the concentration applied.

Keywords
Chlorine dioxide; ozone; hydrogen peroxide; Nicotiana glutinosa ; transmission electron microscopy

RESUMO

O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma cultura altamente suscetível a pragas e doenças. Desde 2014, a indústria do tomate tem enfrentado um vírus emergente chamado tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV), caracterizado por ser transmitido mecanicamente. Portanto, o uso de produtos para inativar esse vírus deve ser implementado em programas de sanitização de estufas. Os objetivos deste trabalho foram: I) avaliar a eficácia do dióxido de cloro (ClO₂), ozônio (O₃) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) na inativação do ToBRFV; e II) conhecer o efeito de cada oxidante sobre a integridade da partícula viral. Um experimento fatorial foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC), com quatro concentrações e três tempos para cada oxidante. Foram realizados testes de confronto direto com seiva infectiva e, posteriormente, inoculação mecânica em Nicotiana glutinosa para contar o número de lesões locais necróticas (NLL) por folha. Para o controle positivo, o dióxido de cloro a 40–60 mg/mL reduziu significativamente as NLL em 28% (Tukey, p < 0,05); o ozônio a 4 mg/mL em 24,8%; e o peróxido de hidrogênio a 5% em 97,2%. Na microscopia eletrônica de transmissão, observou-se fragmentação de algumas partículas de ToBRFV quando expostas ao dióxido de cloro e ao ozônio. No peróxido de hidrogênio a 5%, além da fragmentação, observou-se uma alteração estrutural do capsídeo. Nas condições experimentais do estudo, os produtos atuaram desde o primeiro minuto, e sua eficácia dependeu da concentração aplicada.

Palavras-chave
dióxido de cloro; ozônio; peróxido de hidrogênio; Nicotiana glutinosa ; microscopia eletrônica de transmissão

En la actualidad, el jitomate (Solanum lycopersicum L.) es la segunda hortaliza de mayor importancia a nivel mundial. Su fuerte selección por domesticación y manipulación genética a lo largo del tiempo, lo convierte en uno de los cultivos más susceptibles a plagas y enfermedades (²⁴). Desde 2014, este cultivo se ha enfrentado a un virus emergente denominado tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV) que ha causado epidemias en 35 países de Asia, Europa, América del Norte y África con pérdidas del rendimiento del 15 al 55 % (¹⁶, 30).

Se trata de un virus con morfologia de varilla rígida, perteneciente a la familia Virgaviridae, género Tobamovirus y especie Tobamovirus fructirugosum. Su genoma consiste de una molécula de RNA monocatenario de sentido positivo, con un capuchón metilado en el extremo 5’ y un pseudo RNA de transferencia en el extremo 3’. El genoma viral presenta cuatro marcos de lectura abiertos (ORF´s) que codifican para la replicasa viral (ORF´s 1 y 2), proteína de movimiento (ORF 3) y la proteína de la cápside (ORF 4).

Infecta de forma natural Solanum lycopersicum y Capsicum annum y de manera artificial a Solanum nigrum y Chenopodium murale. Aunque las principales formas de diseminación del ToBRFV son por semilla y mecánicamente por labores culturales, también se ha reportado su transmisión por suelo, agua y sustratos sólidos o líquidos, lo cual muestra su alta infectividad (⁵, ¹⁵, ¹⁸, 30). Se han sugerido diferentes medidas de prevención y manejo contra este virus, de las cuales destaca el adecuado saneamiento para evitar o minimizar su diseminación (⁴, 30).

Diversos investigadores han evaluado la efectividad de biocidas para la inactivación del ToBRFV (⁴, ⁵, ²⁶). Dentro de los biocidas se encuentran los agentes oxidantes tales como el dióxido de cloro (ClO₂), ozono (O₃) y peróxido de hidrógeno (H₂O₂) que se caracterizan por su alta reactividad para oxidar componentes de la pared celular, membrana o cápside viral (¹¹). Estos agentes oxidantes son de amplio espectro y están autorizados por la FDA (U.S. Food and Drug Administration) como desinfestantes en áreas de salud pública e industria de alimentos y en limpieza de sistemas de riego de invernaderos orgánicos (³). Sin embargo, para emplearse en el manejo de fitopatógenos, como el ToBRFV, es necesario evaluar su efectividad porque factores físicos, químicos y biológicos tanto del biocida, patógeno y entorno pueden afectar a la eficacia del oxidante (²⁸). Por lo antes señalado, los objetivos de esta investigación fueron: I) evaluar la efectividad del dióxido de cloro, ozono y peróxido de hidrógeno en la inactivación del ToBRFV y II) conocer el efecto que causa cada oxidante en la partícula viral.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento y mantenimiento del virus

El inóculo se obtuvo de tejido foliar de jitomate (S. lycopersicum L.) infectado con ToBRFV. La presencia del virus se confirmó mediante RT-PCR (Rodríguez-Mendoza et al., 2019) su aislamiento se realizó con la técnica de lesión local única en Nicotiana glutinosa en tres ocasiones (²²). Posteriormente, el inóculo se incrementó en plantas de jitomate var. Floradade.

Germinación y trasplante de Nicotiana glutinosa

En tres charolas de germinación con peat moss estéril como sustrato, se sembraron semillas de N. glutinosa y se mantuvieron a 16 horas luz y 8 oscuridad con lámparas de crecimiento vegetal durante tres semanas. Posteriormente, se llevaron a un invernadero y a las dos semanas se realizó raleo dejando las plantas más vigorosas. Después de una semana las plántulas se trasplantaron en vasos de unicel de 16 oz con una mezcla de suelo orgánico y peat moss estéril (2:1 v/v). Las plantas se fertilizaron con solución nutritiva Steiner (0.25 X) cada tercer día y se mantuvieron a temperatura de 6 a 47.6°C y HR de 60 a 95 %. Los bioensayos se realizaron ocho semanas después de la germinación cuando las plantas tenían de 56 días de edad.

Preparación de agentes oxidantes

Cada oxidante fue preparado de acuerdo a las instrucciones del proveedor a una concentración 2X (Tabla 1). La generación de ozono se realizó utilizando un ozonizador INNOVAOZONO^® y su concentración (disuelto en agua) se midió con el equipo CLEAN DOZ30 y el potencial de óxido-reducción con el aparato ORP-169EE. En el caso del dióxido de cloro se utilizó el producto comercial Cloxifree^®, se cuantificó su concentración inicial con el equipo Palintest ZIINST64 V1 y se prepararon las diluciones a evaluar. Para el peróxido de hidrógeno, se empleó el producto de Química ROAR^® al 50%, a partir del cual se prepararon las concentraciones deseadas (Tabla 1). Se usó agua destilada estéril para la dilución de los agentes oxidantes, la preparación de testigos positivos (concentración cero de cada oxidante + ToBRFV) y para los controles negativos (agua). Se registró pH y ORP de cada concentración inicial (2X) por oxidante (Tabla 1) y las aplicaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente de 20-22 °C.

Tabla 1
Condiciones iniciales de las concentraciones evaluadas por cada agente oxidante.

Oxidante	Concentraciones evaluadas	Concentraciones iniciales (2X)	pH inicial	Potencial de óxido-reducción (ORP) inicial [mV]
Dióxido de cloroA	0	0	6.7	397
	20	40	4.1	712
	40	80	3.9	762
	60	120	3.7	831
OzonoA	0	0	5.5	509
	2	4	4.0	1110
	3	6	3.8	1124
	4	8	3.5	1141
Peróxido de hidrógenoB	0	0	6.7	384
	1	2	4.0	401
	3	6	3.3	420
	5	10	3.1	436

• Nota: Se evaluaron los tiempos 1, 5 y 10 minutos para cada concentración de cada oxidante. Concentración 0 = testigo positivo.
• ^A
  Concentración mg/mL;
• ^B
  Concentración en porcentaje (%).

Preparación de inóculo

El inóculo se obtuvo macerando tejido foliar de la planta de jitomate infectada en agua destilada (1: 10 p/v), mortero y pistilo estériles. El macerado se filtró con manta de cielo estéril y se mantuvo en refrigeración a 4°C hasta su uso.

Diseño experimental y bioensayos

Se realizó un experimento factorial en un diseño experimental completamente al azar (DECA) por oxidante en sus diferentes concentraciones y tiempos (Tabla 1). Se agregaron 2 ml del inóculo + 2 ml del agente oxidante (2X) (ensayos de confrontación directa) en tubos falcon estériles de 15 ml, agitando suavemente el tubo de forma manual por unos segundos después de lo cual se mantuvieron durante el tiempo establecido (Tabla 1). Posteriormente, se tomaron 500 µl de la mezcla y se transfirieron a un tubo eppendorf que contenía 500 µl de amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.2, tiosulfato de sodio al 2 % como agente neutralizante del oxidante y 0.1 g/ml de carborundum 300 mallas como abrasivo. El tubo eppendorf se agitó con vórtex y se tomaron 100 µl para realizar la transmisión mecánica en hojas de N. glutinosa (Figura 1). Para cada combinación concentración/tiempo se inocularon la cuarta, quinta y sexta hoja de 5 plantas (15 hojas por tratamiento). Por cada agente oxidante se inocularon 60 plantas más 12 plantas como testigos negativos (2 plantas por combinación concentración/tiempo). En total se inocularon 216 plantas [180 de los tratamientos (incluyendo la concentración 0 como testigo positivo) más 36 testigos negativos]. Las plantas se mantuvieron en invernadero y cinco días después de la inoculación (ddi) se realizó un muestro destructivo (corte de hojas inoculadas) para el conteo del número de lesiones locales necróticas (NLL).

Figura 1
Materiales y métodos para evaluar la efectividad de los agentes oxidantes contra ToBRFV mediante bioensayos en N. glutinosa. A) Confrontación de macerado con agente oxidante. B) Toma de alícuota de ensayo de confrontación. C) Homogenización con amortiguador de fosfatos, carborundum y tiosulfato de sodio. D) Toma de alícuota para inoculación. E) Transmisión mecánica. F) Conteo de lesiones locales 5 días después de transmisión (ddt).

Conteo y efectividad en la reducción de lesiones locales necróticas

Se digitalizaron las hojas recolectadas de cada tratamiento con un escáner marca Brother MFC-J44200w. Las imágenes se guardaron en formato .jpg para realizar el conteo del NLL con RStudio v4.2.3 (⁶) y la paquetería Pliman (²¹) diferenciando por colorimetría de imagen al tejido sano, dañado y fondo de imagen. El porcentaje de reducción del NLL por hoja se determinó tomando como referencia la concentración cero (testigo positivo) de cada tratamiento con la siguiente fórmula:

$\mathrm{Reducción}\mathrm{del}\mathrm{NLL}(\%)=\left[\right(\mathrm{promedio}\mathrm{del}\mathrm{NLL}\mathrm{de}\mathrm{testigo}\mathrm{positivo}-\mathrm{promedio}\mathrm{del}\mathrm{NLL}\mathrm{de}\mathrm{tratamiento})/\mathrm{promedio}\mathrm{del}\mathrm{NLL}\mathrm{de}\mathrm{testigo}\mathrm{positivo}]*100$

Análisis estadístico

Los datos obtenidos por cada agente oxidante en sus diferentes combinaciones de concentración y tiempo de exposición fueron sometidos a prueba de normalidad (Shapiro-Wilk p > 0.05). Posteriormente, se realizó un ANOVA en un diseño factorial (p < 0.05, α=0.05), considerando los siguientes factores: concentración, tiempo y repetición por cada agente oxidante. Para la prueba de Shapiro-Wilk p < 0.05, se hizo una transformación a raíz cuadrada (√ y), logaritmo natural (ln y), logaritmo base 10 (log y) y cuadrática del número de lesiones locales y la comparación múltiple de medias se realizó con la prueba de Tukey (α = 0.05). Todos los análisis se llevaron a cabo en R Studio v4.2.3 (⁶) con la paquetería Agricolae usando las funciones emmeans, lsmeans y multcomp.

Detección de ToBRFV en lesiones locales necróticas

Para asegurar que las lesiones obtenidas fueron causadas por ToBRFV, se formaron muestras compuestas de 20 lesiones locales por tratamiento con un bisturí estéril para realizar extracción de RNA total con el kit SV total RNA Isolation System (Promega^®). La calidad y concentración del RNA se cuantificó en un Nanodrop 2000/2000c (Thermo Scientific^®) y se realizó RT-PCR con los iniciadores y protocolo descrito por Rodríguez-Mendoza et al. (²⁷). Los productos amplificados fueron separados en electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizaron en un fotodocumentador (Quantum, Vilber^®).

Microscopía electrónica de transmisión

Para conocer el efecto de los agentes oxidantes en las partículas virales, se realizó el mismo procedimiento explicado anteriormente para los ensayos de confrontación directa con las concentraciones mínimas y máximas empleadas para cada oxidante a los 10 min, incluyendo un testigo negativo (agua) (Tabla 1). Se tomaron 30 µl de inóculo después del tratamiento y se mezclaron por pipeteo con 30 µl de ácido fosfotúngstico al 2% como contrastante para realizar una tinción negativa en rejillas de cobre de 300 mallas (FF300-Cu, Electron Microscopy Sciences Inc.). De cada una de las rejillas se tomaron cinco micrografías (cuatro campos periféricos y uno al centro) en el microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai G2 Spirit TWIN 120 kV (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 23,000, 46,000 y 97,000X.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efectividad de los agentes oxidantes

La efectividad de cada agente oxidante se determinó considerando la reducción del NLL en N. glutinosa con respecto a su testigo positivo (concentración cero). Dióxido de cloro presentó diferencias significativas en el promedio del NLL a nivel concentración (p <1.32e-11), pero no para tiempo e interacción concentración / tiempo (p >0.05) (Figura 2A). Las concentraciones 40 y 60 mg/mL de dióxido de cloro (NLL= 103 y 101, respectivamente) presentaron una reducción del 28% en el NLL con relación a su testigo positivo (NLL= 144) (Figuras 2D-3A). En relación al ozono, solamente se obtuvieron diferencias significativas a nivel concentración (p 2.52e^-08) (Figura 2B), donde el tratamiento de 4 mg/mL de ozono (NLL= 108.2) presentó una reducción del 24.8 % en el NLL con referencia a su testigo positivo (NLL= 174) (Figuras 2D-3B). Por otra parte, peróxido de hidrógeno presentó diferencias significativas a nivel concentración (p < 2e-¹⁶), tiempo (p = 0.00128) e interacción concentración / tiempo (p = 0.00389) (Figura 2C). Las tres concentraciones fueron estadísticamente diferentes (Tukey p < 0.05) en el NLL (38.2,10.48 y 4.66, respectivamente) con respecto al testigo positivo (NLL = 167), indicando que, a mayor concentración del compuesto, mayor inactivación de partículas virales (Figuras 2D-3C). El tratamiento de peróxido de hidrógeno al 5% tuvo la menor cantidad del NLL (4.66), con una reducción del 97.2 % en el NLL (Figuras 2D-3C). Asimismo, en la interacción concentración / tiempo, se observó un aumento del NLL de los tratamientos 1 y 3% a 10 min con respecto a 1 y 5 min (Figura 2-C.2).

Figura 2
Efecto de los agentes oxidantes en la reducción del número de lesiones locales necróticas (NLL) causadas por ToBRFV en N. glutinosa. A) dióxido de cloro; A.1= promedio del NLL por concentración; A.2= promedio del NLL por concentración en los tres tiempos evaluados (1, 5 y 10 min). B) ozono; B.1= promedio del NLL por concentración; B.2= promedio del NLL por concentración en los tres tiempos evaluados (1, 5 y 10 min). C) peróxido de hidrógeno; C.1= promedio del NLL por concentración; C.2= promedio del NLL por concentración en los tres tiempos evaluados (1, 5 y 10 min). D) porcentaje de reducción del NLL de las concentraciones con diferencias significativas (p <0,05) de cada agente oxidante evaluado en referencia a la concentración 0. ClO₂: dióxido de cloro, O₃: ozono, H₂O₂: peróxido de hidrógeno. Los datos representan la media ± DE. Letras diferentes indican diferencias significativas (p <0,05).

Figura 3
Lesiones locales necróticas formadas en N. glutinosa en las concentraciones evaluadas por cada agente oxidante e identificación molecular de ToBRFV. A) dióxido de cloro (ClO₂); B) ozono (O₃); C) peróxido de hidrógeno (H₂O₂). D) Identificación de ToBRFV por RT-PCR en lesiones locales necróticas; MP=marcador de peso molecular de 100 pb (Promega^®); C+= control positivo; C-=control negativo de RT-PCR

De acuerdo con las condiciones evaluadas, se tuvo mayor reducción del NLL al incrementar la concentración de los diferentes oxidantes (Figuras 2-3), pero sin diferencias significativas (p >0.05) en los tiempos evaluados para la mayoría de las observaciones (Figura 2). Por lo tanto, la acción de cada agente oxidante evaluado contra ToBRFV en la presente investigación está influenciada por la concentración y no por el tiempo.

En el caso del peróxido de hidrógeno, las variaciones observadas en el NLL al 1 y 3 % durante 10 min (Figura 2-C.2) pueden deberse a diversos factores químicos, físicos y biológicos (¹⁴, ²⁸) que pueden afectar a un agente oxidante, donde se incluyen la concentración del oxidante, período de contacto, pH, temperatura, presencia de materia orgánica y/o el microorganismo a controlar (¹¹, ¹⁴). En este sentido, el macerado no solamente contenía partículas virales, sino también moléculas orgánicas provenientes de la lisis celular que pueden reducir la acción viricida de los agentes oxidantes (¹⁴). Asimismo, es importante considerar que la rápida acción de los oxidantes contra moléculas orgánicas (¹³) puede limitar su capacidad para inactivar a todas las partículas virales presentes en el medio. En relación a la mayor concentración de peróxido de hidrogeno (5%) evaluada, donde se obtuvo la mayor efectividad (97.2%), se observó una reducción constante del NLL en los tres tiempos (Figura 2-C.2).

Las concentraciones estudiadas de los tres oxidantes fueron evaluadas en una sola aplicación, lo que puede limitar la efectividad de los agentes oxidantes en relación al período de contacto. Dióxido de cloro y ozono son gases disueltos en agua con gran capacidad de oxidación (⁹), pero con vida útil relativamente corta al ser inestables (¹³, ²⁰, ²⁵), por lo cual es recomendable evaluar la efectividad de estos oxidantes en sistemas donde se pueda mantener un flujo constante del producto por un tiempo determinado. Mehle et al. (¹⁹) encontraron que partículas de ToBRFV pueden permanecer infectivas hasta cuatro semanas en agua almacenada, por lo cual es importante como medida fitosanitaria realizar tratamientos periódicos al agua utilizada en sistemas de riego o almacenada en depósitos sin dejar residualidad. En este caso, el uso de ozono y dióxido de cloro serían los más recomendables ya que no dejan residuos duraderos (²⁰, ²⁵). También se ha reportado que la forma de aplicación de un biocida (acuoso o gaseoso) puede influir en su efectividad contra patógenos (⁷). Dióxido de cloro, ozono y peróxido de hidrógeno son usados en la industria de alimentos en forma gaseosa para la inactivación y reducción de diversos microorganismos (¹⁵, ¹⁷, ²⁹); por lo que sería conveniente evaluar su efectividad en forma gaseosa para conocer la capacidad de inactivación de partículas del ToBRFV en superficies y determinar las mejores dosis y/o tiempos de exposición.

La presencia de materia orgánica también interfiere en la efectividad de los agentes oxidantes (¹⁴). En invernaderos con plantas infectadas con ToBRFV, las partículas virales se encuentran en los restos de material vegetal, por esta razón, es recomendable retirarlos para llevar a cabo un correcto proceso de desinfestación con estos compuestos.

El tipo de estructura viral es otro factor importante que influye en la efectividad de los agentes oxidantes. Los virus con envoltura se caracterizan por tener una cubierta lipídica que los hace más susceptibles a la oxidación comparados con los virus sin envoltura que presentan mayor resistencia a los desinfestantes (¹⁴). La inactivación de virus sin envoltura como el ToBRFV requiere de agentes oxidantes que desnaturalicen a las proteínas redundantes de la cápside y causen daño en el genoma (¹⁴). Se ha reportado que dióxido de cloro (24 mg/mL en 10 seg), ozono (0.2 a 0.8 mg/mL en 1 min) y peróxido de hidrógeno (3% / 5 min; pH 2.5) han sido efectivos contra SARS-CoV-2 (virus con envoltura) en un 99.9% (¹, ¹⁸), mientras que, para variantes de Norovirus (virus sin envoltura) la efectividad de estos agentes oxidantes ha sido menor (¹³, ²³). Asimismo, se sabe que los tobamovirus son extremadamente resistentes a agentes físicos y químicos, altas temperaturas y a la deshidratación (⁷) lo cual podría explicar su persistencia después de su contacto con los agentes oxidantes evaluados en esta investigación.

Detección de ToBRFV en lesiones locales necróticas

En este estudio, las lesiones locales necróticas en hojas de N. glutinosa comenzaron a observarse a partir de 3 ddi y se cuantificaron a los 5 ddi para evitar que su coalescencia dificultara su registro. Se ha reportado que ToBRFV genera lesiones locales necróticas en Nicotiana benthamiana, N. glutinosa y N. sylvestris entre los 4-7 ddi, así como colapso de las hojas entre los 7-14 ddi (⁴, ¹⁶). Por otro lado, a partir de las lesiones locales necróticas formadas en las hojas de N. glutinosa de los diferentes tratamientos (Figura 3) se tuvo la amplificación del fragmento esperado de 475 pb de la región codificante de la replicasa viral (ORF1) del ToBRFV mediante RT-PCR, lo cual demostró su infectividad después del contacto con los oxidantes evaluados.

Efecto de los agentes oxidantes en la integridad de la partícula viral

Los viriones del ToBRFV tienen la forma típica del género tobamovirus consistente en una varilla rígida de aproximadamente 300 nm de longitud x 18 nm de diámetro (², ¹⁶, 30). En los tratamientos con dióxido de cloro y ozono se observaron partículas fragmentadas y no fragmentadas en las diferentes concentraciones evaluadas (Figura 4). Por otra parte, con peróxido de hidrógeno al 5% se observó una pérdida de integridad de la cápside además de la fragmentación de partículas mientras que con peróxido de hidrógeno al 1% solamente se observaron partículas fragmentadas (Figura 4E-F). Peróxido de hidrógeno al 5% redujo el NLL en 97.2% mientras que al 1% la reducción fue del 77% (Figura 2D). Se ha determinado que la aplicación de biocidas a altas concentraciones causan mayor daño a nivel macromolecular (⁸), lo cual fue claramente observado en el caso del peróxido de hidrógeno al 5 %, donde se registró un menor NLL y mayor fragmentación y daño estructural de las partículas virales (Figuras 3C-4F). En investigaciones con otros tobamovirus, se ha hecho uso de microscopia electrónica de transmisión para evidenciar el daño causado a las partículas virales por tratamientos físicos. Filipić et al. (⁷) evaluaron la inactivación del tobamovirus pepper mild mottle virus (PMMoV) por plasma atmosférico frío, determinando que dicho tratamiento causa fragmentación de la partícula viral un minuto después de su exposición. Por su parte, Hong et al. (¹⁰) encontraron que la irradiación gamma altera la estructura de la cápside, degrada la proteína viral y el RNA genómico del tobamovirus cucumber green mottle mosaic virus.

Figura 4
Partículas virales de ToBRFV después de ensayos de confrontación con los agentes oxidantes evaluados a 10 min. A) agua destilada estéril; B) dióxido de cloro a 20 mg/mL; C) ozono a 2 mg/mL; D) ozono a 4 mg/ml; E) peróxido de hidrógeno al 1%; F) peróxido de hidrógeno al 5%. Flechas rojas muestran fragmentación de partículas virales.

Debido a las propiedades físico-químicas y forma de acción de estos agentes oxidantes, podrían incluirse en un esquema de manejo integrado de la enfermedad al término del ciclo de cultivo para desinfestar, entre otros, el interior de los invernaderos, almácigos y cajas de plástico donde se recolectan los frutos cosechados.

En conclusión, el efecto del dióxido de cloro, ozono y peróxido de hidrógeno en la reducción del número de lesiones locales necróticas causadas por ToBRFV en N. glutinosa estuvo relacionado con el aumento de concentración sin efecto del tiempo. De acuerdo a las características físico-químicas de cada oxidante se recomienda investigar la efectividad del ozono y dióxido de cloro en la inactivación de ToBRFV en sistemas que permitan mantener un flujo constante durante un periodo determinado de contacto. Por otro lado, el peróxido de hidrógeno al 5% podría ser usado para inactivar partículas del ToBRFV que pudieran estar presentes en diferentes superficies dentro del invernadero como plásticos y concreto, pero no sobre materiales metálicos por su efecto altamente oxidante en éstos.

• Armenta-Cárdenas, M.J.; Ochoa-Martínez, D.L.; Zamora-Macorra, E.J.; Aranda-Ocampo, S.; Tafoya-Chavarria, O.G. Efectividad de agentes oxidantes en la inactivación del tomato brown rugose fruit virus. Summa Phytopathologica, v.52, p.1-10, 2026.
• Armenta-Cárdenas, M.J.; Ochoa-Martínez, D.L.; Zamora-Macorra, E.J.; Aranda-Ocampo, S.; Tafoya-Chavarria, O.G. Effectiveness of oxidizing agents in tomato brown rugose fruit virus inactivation. Summa Phytopathologica, v.52, p.1-10, 2026.
• Armenta-Cárdenas, M.J.; Ochoa-Martínez, D.L.; Zamora-Macorra, E.J.; Aranda-Ocampo, S.; Tafoya-Chavarria, O.G. Eficácia de agentes oxidantes na inativação do tomato brown rugose fruit virus. Summa Phytopathologica, v.52, p.1-10, 2026.

Declaração de disponibilidade de dados

Os dados de pesquisa estão disponíveis no corpo do artigo.

REFERENCIAS

• ¹ Carducci, A.; Federigi, I.; Liu, D.; Thompson, J.R.; & Verani, M. Making Waves: Coronavirus detection, presence and persistence in the water environment: State of the art and knowledge needs for public health. Water Research, Amsterdam, v.179, p.1-9, 2020. DOI: https://doi.org/10.1016/j.watres.2020.115907
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• ² Caruso, A. G.; Bertacca, S.; Parrella, G.; Rizzo, R.; Davino, S.; & Panno, S. Tomato brown rugose fruit virus: A pathogen that is changing the tomato production worldwide. Annals of Applied Biology, London, v.181, n.3, p. 258-274, 2022. DOI: https://doi.org/10.1111/aab.12788
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• ³ Code of Federal Regulations. Agriculture: 7 CFR § 205.601 Washington, D.C.: US Federal register documents, 2023. Disponible en: < eCFR :: Title 7 of the CFR -- Agriculture>. Acceso en: 14 jun. 2023.
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Editado por

• EDITOR CIENTÍFICO:
  Edson Luiz Furtado

• EDITOR associado:
  Rita de Cássia Panizzi 0000-0002-0289-6563

Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  02 Mar 2026
• Fecha del número
  2026

Histórico

• Recibido
  14 Nov 2023
• Acepto
  25 Mayo 2025