Detecção molecular de hemoplasmas em gatos domésticos de diferentes regiões do Brasil

Dias, Clara Morato; Francisco, Kamila Pinheiro; Oliveira, Gabriela Veiga; Silva, João Vitor dos Santos Alves da; Franco, Eliz Oliveira; Lee, Daniel Antônio Braga; Ribeiro, Dália Monique Machado; Furquim, Maria Eduarda Chiaradia; Figueiredo, Mayra Araguaia Pereira; Machado, Rosangela Zacarias; André, Marcos Rogério

doi:10.1590/S1984-29612025035

person Clara Morato Dias

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person Kamila Pinheiro Francisco

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person Gabriela Veiga Oliveira

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person João Vitor dos Santos Alves da Silva

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person Eliz Oliveira Franco

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person Daniel Antônio Braga Lee

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person Dália Monique Machado Ribeiro

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person Maria Eduarda Chiaradia Furquim

schoolLaboratório e Hemocentro Veterinário – HEMOLABVET, Ribeirão Preto, SP, Brasil

person Mayra Araguaia Pereira Figueiredo

schoolLaboratório de Parasitologia, Entomologia e Biologia Molecular Aplicada à Saúde Única, Universidade Federal de Rondônia – UNIR, Rolim de Moura, RO, Brasil

person Rosangela Zacarias Machado

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

person Marcos Rogério André *

schoolLaboratório de Bioagentes Transmitidos por Vetores, Departamento de Patologia, Reprodução e Saúde Única, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal, SP, Brasil

0000-0002-1713-5222

person*Corresponding author: Marcos Rogério André. E-mail:
mr.andre@unesp.br

Assistant Scientific Editor:

Maristela Peckle Peixoto

Conflict of interest

The authors declare no competing interests.

Molecular Marker	Primers	Thermal conditions	Reagent concentrations	Amplicon size (bp)	Reference
gapdh	GAPDH-F (5’- CCTTCATTGACCTCAACTACAT-3’)	95 °C for 5min; 35 cycles of 95 °C for 15s, 50 °C for 30s and 72 °C for 30s; 72 °C for 5min	5 μL of sample DNA	450	Birkenheuer et al. (2003)

	GAPDH-R (5’- CCAAAGTTGTCATGGATGACC -3’)		0.2 mM dNTPs

			0.4 μM of each primer

			3.0 mM MgCl₂,

			1.25 U Taq Platinum DNA Polimerase
16S rRNA	SYBR_For (5'-AGCAATRCCATGTGAACGATGAA-3')	50 °C for 2min, 95 °C for 10min; 40 cycles of 95 °C for 15s, 60 °C for 1min	1 μL of sample DNA	259	Willi et al. (2009)

	SYBR_Rev2 (5'-GCTGGCACATAGTTAGCTGTCACT-3')	Melting curve: 95 °C for 15s, 60 °C for 20s, increase from 60 °C to 95 °C for 20min and 95 °C for 15s	0.3 μM of each primer

			12.5 μL of 2 x SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems)

16S rRNA	First round:	95 °C for 4min; 40 cycles of 95 °C for 15s, 60 °C for 30s and 72 °C for 15s; 72 °C for 7min	4 mM MgCl₂	1,107	Di Cataldo et al. (2020) and Millán et al. (2019)
	HemoF1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')
			1 µM of each primer
	HemoR2 (5'-TACCTTGTTACGACTTAACT-3')
			0.2 mM dNTPs
	Second round:
	HemoF1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')		1X buffer solution

	HemoR2 (5'-TACCTTGTTACGACTTAACT-3')		1.25 U of Taq GoTaq^® G2 Hot Start Taq Polymerase (Madison, Wisconsin, USA)

			First reaction: 5 μL of sample DNA

			Second reaction: 1 μL of amplicon
23S rRNA	23S_HAEMO_F (5′-TGAGGGAAAGAGCCCAGAC-3′)	94 °C for 3min; 35 cycles of 94 °C for 30s, 54 °C for 30s and 72 °C for 60s; 72 °C for 10min	5 µL of sample DNA	800	Mongruel et al. (2020)

	23S_HAEMO_R (5′-GGACAGAATTTACCTGACAAGG-3′)		1X buffer solution

			1.5 mM MgCl₂

			0.2 mM dNTP

			0.4 mM of each primer

			2.5 U of Taq Platinum DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbald, California, USA)

Sample identification (Origin)	Tm – Melting Temperature (°C) of the sample	Quantification (copies of a fragment of the 16S rRNA gene/μL)	Cq (Quantification Cycle)
57 (São Paulo)	76.5	2.65 x 10²	11.49
51 (Minas Gerais)	77	2.75 x 10¹	19.10
108 (Minas Gerais)	77.5	5.50 x 10⁰	21.51
116 (Minas Gerais)	77.5	6.35 x 102	17.86
22 (Minas Gerais)	77.5	*	*
36 (Minas Gerais)	76.5	*	*
39 (Goiás)	77.5	1.42 x 10⁴	20.1
104 (Goiás)	76.5	9.54 x 10¹	27.75
I19 (Rondônia)	76.5	1.76 x 10⁴	21.1

Gene	bp	N	VS	GC%		g	gd (mean ± SD)	π (mean ± SD)	K
16S rRNA	470	65	14	43.1	16		0.790±0.038	0.00363± 0.00035	1.675
23S rRNA	667	6	372	39.3	6		0.00926±0.096	0.0118872±0.10903	131.33333

[TFN1] ^*
Non-quantifiable positive sample (differences between Cq values greater than 0.5, even after triplicate repetition, probably due to the Monte Carlo effect - Bustin et al., 2009).