UM BREVE ESTUDO SOBRE A INATIVAÇÃO DA TOXINA MICROCISTINA-LR POR IRRADIAÇÃO GAMA E ANÁLISE POR METODOLOGIAS HPLC-SPE ONLINE E ESPECTROMETRIA DE MASSAS

A BRIEF STUDY ON THE INACTIVATION OF MICROCYSTIN-LR TOXIN BY GAMMA IRRADIATION AND ANALYSIS BY HPLC-SPE ONLINE AND MASS SPECTROMETRY METHODOLOGIES

Resumo

Many of the toxins produced by cyanobacteria have multiple variants, some being more toxic than others. Microcystins are a group of toxins produced by cyanobacteria that have approximately 100 variants with LD₅₀ (lethal dose 50%) values ranging from 25 to 1000 μg kg^-1. The main target of microcystins in the human body is the liver. A concentration of 1.0 μM microcystin-LR, the toxin studied in this work, can produce threefold greater phosphorylation of cytokeratins in rat hepatocytes. A mixture of toxins from the microcystin class and originating from cyanobacteria was separated by the technique of high-performance liquid chromatography - online solid phase extraction (HPLC-SPE) in order to analyze the most toxic variant of them, microcystin-LR. The study consisted of investigating the inactivation of this toxin by gamma irradiation. For this purpose, microcystin-LR was irradiated with Cs¹³⁷ source with varying doses of 1.0 to 8.0 kGy. The techniques of HPLC-SPE and mass spectrometry with triple quadrupole analyzer and electron spray ionization (ESI) system were used to study the effects of this inactivation by irradiation. Among the results it was demonstrated that the 1.0 kGy dosage was not sufficient to reduce the concentration of microcystin-LR below the maximum allowed value established by Brazilian legislation.

Keywords:
microcystins; gamma irradiation; inactivation.

INTRODUÇÃO

O Brasil possui uma das maiores reservas de água doce do mundo. Entretanto, o país não garante, por uma série de motivos, o abastecimento de água potável para toda a população. Segundo o pesquisador do Instituto de Pesquisas Econômicas Aplicadas (IPEA), César N. Castro,¹ um dos grandes desafios é equacionar o equilíbrio entre a disponibilidade hídrica existente e a procura por múltiplos usos. O termo segurança hídrica surgiu da preocupação com a necessidade de preservar as fontes dos recursos hídricos para que o uso presente não comprometa o seu uso futuro incluindo aí a função de regulação de ciclos da natureza. Entretanto, para os pesquisadores Freitas e Araújo,² segurança hídrica vai muito além da disponibilidade de água. Trata-se de garantir também a proteção contra a poluição hídrica e a preservação de ecossistemas. O artigo técnico de Freire e Souza Filho³ enfatiza o problema da poluição na questão da segurança hídrica tratando também de ambientes eutrofizados de rios e lagos. E, como uma das consequências da eutrofização, as concentrações elevadas de cianobactérias e a liberação de cianotoxinas para os recursos hídricos têm sido preocupações emergentes no âmbito da pesquisa, da gestão e da prestação de serviços de saneamento, que exigem tratamento de água cada vez mais complicados.

O equilíbrio em condições ambientais complexas como altas concentrações de nutrientes, ambientes eutrofizados, luz solar, temperatura, pH, condutividade, salinidade e disponibilidade de carbono em corpos aquáticos de fluxo lento ou estagnados favorecem o aparecimento de florações de cianobactérias. Esta ocorrência afeta negativamente a qualidade da água impossibilitando seu uso para consumo, agricultura, pesca, condições sanitárias e recreativas, afetando inclusive seu gosto e odor.⁴ Além deste cenário, cianobactérias são responsáveis pela liberação de diversos tipos de toxinas que podem ocasionar problemas de saúde que vão desde uma irritação na pele até a promoção de tumores no fígado, ataque ao sistema nervoso central e morte.⁵ Muitas destas toxinas têm múltiplas variantes, com algumas sendo mais tóxicas que outras.

Produzidas por cianobactérias as microcistinas são toxinas que possuem cerca de 100 variantes com LD₅₀ (dose letal 50%) que variam de 25 a 1000 μg kg^-1. São heptapeptídeos com peso molecular que varia entre 900 e 1100 Daltons (Da) e são consideradas biologicamente estáveis, podendo permanecer ativas na coluna d’água durante várias semanas ou meses.⁶ Mais de 200 heptapeptídeos são sintetizados por diferentes espécies de cianobactérias como Anabaena, Microcystis, Plankothrix, Nostoc e Aphanizomenon.⁷

Todas as microcistinas compartilham uma estrutura molecular em comum. Contendo três D-aminoácidos - alanina, ácido glutâmico e ácido metil aspártico -, um metil de hidro alanina (Mdha), o ácido 3-amino-9-metóxi-2,6,8-timetil-10-fenil-4,6-dienóico (Adda) e dois L-aminoácidos - nas posições X e Z que são preenchidas por aminoácidos que caracterizam propriedades diferenciadas nas microcistinas. No caso da microcistina-LR, X e Z correspondem respectivamente a leucina (L) e arginina (R)⁸,⁹ (Figura 1, Tabela 1).

Tabela 1
Algumas variantes detectadas em florações tóxicas¹⁰

Variante	[X]	[Z]
Microcistina-RR	arginina	arginina
Microcistina-YR	tirosina	arginina
Microcistina-LR	leucina	arginina
Microcistina-LA	leucina	alanina
Microcistina-LY	leucina	tirosina
Microcistina-LF	leucina	fenilalanina
Microcistina-LW	leucina	triptofano

Figura 1
Estrutura da molécula de microcistina-LR

Cerca de 80% da exposição à cianotoxinas por humanos resulta do consumo de água contaminada, seguido pelo consumo de vegetais e outros tipos de alimentos provenientes de ambientes aquáticos.¹¹ As microcistinas já têm sua letalidade comprovada por seu histórico de atuação. Uma evidência de intoxicação humana ganhou repercussão internacional e chamou atenção para a gravidade da atividade da microcistina. Na cidade de Caruaru-PE, em 1996, ocorreu uma tragédia na qual foram vitimadas 56 pessoas devido a utilização de água contaminada com a microcistina-LR para o processo de hemodiálise.¹²

Descrição da toxicidade em humanos

O principal alvo das microcistinas no organismo humano é o fígado. No estudo de Leal e Soares¹³ verificou-se que na concentração de 1,0 μM de microcistina-LR ocorre uma fosforilação três vezes maior de citoqueratinas em hepatócitos de ratos. A inibição da atividade das proteínas fosfatases leva a mudanças morfológicas na membrana plasmática pela hiperfosforilação de citoqueratinas, que são constituintes do citoesqueleto das células, e à atividade de promoção tumoral pelas proteínas hiperfosforiladas.

Devido a configurações relativas à sua estrutura heptapeptídica cíclica, as microcistinas possuem uma forte afinidade por proteínas serina/treonina fosfatases. Essas proteínas se dividem em seis subtipos PP1, PP2A, PP2B, PP4, PP5 e PP7. Essa divisão é baseada nos critérios de características bioquímicas, sensibilidade a inibidores e substratos específicos. As proteínas PP1 (fosfoproteína fosfatase 1) com peso molecular de 32 kDa e a proteína fosfatase PP2A são as fosfoproteínas que mais reagem com as moléculas de microcistinas.¹⁴

Inspeções visuais na estrutura cristalina da ligação entre microcistinas e as proteínas (PP1 e PP2A) revelam a presença de dois elementos chaves para que ocorra a interação de microcistinas com as subunidades catalíticas das fosfatases induzindo a sua inativação. A primeira etapa envolve a interação da microcistina com a enzima. Segundo estudos,⁷ esta interação é facilitada por uma similaridade conformacional entre a toxina e determinados substratos das proteínas PP1 e PP2A. Na segunda etapa ocorre a ligação covalente do aminoácido Adda da microcistina com aminoácidos específicos em cada fosfatase (PP1 e PP2A) formando um aduto e inativando as proteínas permanentemente.¹⁵

Irradiação gama

Um documento emitido pela Agência Internacional de Energia Atômica (IAEA, International Atomic Energy Agency)¹⁶ em 2008 faz um apanhado de várias publicações de diversos países - incluindo o Brasil - descrevendo os mais importantes resultados alcançados na efetivação do uso da irradiação gama e/ou feixe de elétrons, que são utilizados de forma isolada ou em combinação com outras técnicas, na decomposição de compostos orgânicos em solução aquosa e na inativação de micro-organismos e parasitas.

Neste documento, o trabalho de Rela et al.¹⁷ descreve as etapas de um experimento realizado com irradiação gama e feixe de elétrons pelo Instituto de Pesquisas Energéticas (IPEN) para o tratamento de águas superficiais do estado de São Paulo. Os testes foram realizados utilizando feixe de elétrons para a degradação de trihalometanos e radiação gama com uma fonte de Co⁶⁰ para a remoção de geosmina em concentrações de 1,0 a 100,0 ng L^-1. O documento traz ainda trabalhos descrevendo o processo de irradiação gama usado em degradação de pesticidas, corantes e medicamentos no tratamento de água em diversos países.

Na área de alimentos, Aquino e Lui¹⁸ realizaram um estudo em 2017 com o objetivo de avaliar a qualidade microbiana de 60 amostras de derivados de ovos e analisar os efeitos da irradiação gama, utilizando uma fonte de Co⁶⁰ e doses de 5,0 e 10 kGy para descontaminação dos produtos coletados no mercado varejista de São Paulo. A esterilização microbiana eficaz de todos os produtos ocorreu com a dose de 10 kGy.

Entretanto, em 2018, um artigo Harrell et al.¹⁹ alerta que o uso da irradiação gama na descontaminação de alimentos induz a geração de radicais livres que podem modificar a estrutura e/ou a atividade de vitaminas, reduzindo seu potencial nutritivo e sua capacidade de serem absorvidas pelo organismo humano. A publicação ainda traz estudos de que polímeros como PVC (policloreto de vinila), PC (policarbonato), PMMA (polimetilmetacrilato) e PP (polipropileno) têm suas estruturas alteradas durante processos de esterilização por irradiação gama com doses acima de 25,0 kGy.

A irradiação gama é uma radiação eletromagnética emitida quando um núcleo decai por emissão de uma partícula α ou β. Após essa emissão o núcleo residual tem seus núcleos (prótons e nêutrons) fora da configuração de equilíbrio, ou seja, estão alocados em estados excitados. Assim, para atingir o estado fundamental, o núcleo emite a energia excedente sob a forma de radiação gama (γ).²⁰

Sob efeito desta irradiação a molécula de água, por exemplo, sofre radiólise. Os elétrons livres produzidos podem polarizar as moléculas próximas de água formando um elétron hidratado (e^-_aq.) de vida relativamente longa. Estes elétrons hidratados e os radicais H^• e OH^• - que também são formados - se difundem, podendo reagir com moléculas orgânicas presentes e modificá-las. Outras espécies reativas que podem ser formadas no processo são: O₂^•-, HO₂^• e H₂O₂.²¹

As fontes de radiação ionizante cujo uso está autorizado são: os raios gama com a utilização dos radioisótopos Co⁶⁰ ou Ce¹³⁷, feixes de elétrons acelerados de energias inferiores a 10 MeV e raios-X com energia inferior a 5 MeV. Essas fontes transmitem uma certa quantidade de energia por unidade de massa, a chamada dose de irradiação. Importante frisar que o produto irradiado não se torna radioativo.

A unidade internacional de medida de irradiação é o Gray (Gy). Um Gray representa um joule de energia absorvida por um quilograma de massa irradiada. A dose letal para seres humanos está na faixa de 1,2 a 11 Gy.²²

Ainda são feitos estudos e aplicações da irradiação gama em processos de esterilização dos mais diversos materiais para a área de saúde, alimentação e agricultura; modificações em materiais poliméricos, nano materiais, de construção e de engenharia de uma forma geral; estudos na área médica e biológica envolvendo a interação da irradiação gama com os mais diversos tipos de células. Na área de alimentos a técnica de irradiação gama foi introduzida na legislação sanitária no Brasil na década de 60. Em 2001, a agência de vigilância sanitária (ANVISA)²³ publicou a Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) No. 21 em que aprova o regulamento técnico para irradiação de alimentos. E, em 2019, a mesma ANVISA²⁴ divulgou uma instrução normativa regularizando o uso de irradiação gama em indústrias farmacêuticas que utilizam este processo na fabricação de medicamentos. O processo atua ainda nas áreas de desinfecção de insetos, parasitas e redução da carga microbiana e fúngica.²⁵

A maioria dos estudos publicados sobre degradação induzida de microcistina diz respeito às técnicas de processos de oxidação avançados (POA). O gerenciamento desta técnica inclui uma série de variáveis como: o tipo de microcistina presente, o tipo de oxidante a ser utilizado, o tempo de contato e a dosagem do mesmo na matriz. Acrescentando que ainda devem ser feitos estudos sobre a qualidade da água que receberá o tratamento e, também, levantamento de parâmetros como pH e carbono orgânico dissolvido, por exemplo.¹⁰ Além do mais, uma preocupação crescente com estes processos são os produtos formados por oxidação no final da técnica utilizada que podem se transformar em poluentes secundários. Em virtude das condições físico-químicas citadas acima a mineralização completa de microcistinas em água pode se tornar inviável.²⁶,²⁷ Hepatoxinas dissolvidas em água não são removidas por tratamentos convencionais.²⁸ A vantagem ecológica e tecnológica do processo de irradiação, em comparação aos processos físico-químicos e biológicos, é a não adição de compostos químicos. A irradiação gama é um processo que pode efetivamente desempenhar um papel ativo na degradação das moléculas de microcistinas devido a sua forte capacidade de penetração.

PARTE EXPERIMENTAL

Objetivo

O objetivo deste trabalho é utilizar a irradiação gama para induzir a degradação de uma das toxinas mais letais conhecidas: a microcistina-LR, contribuir para a base de conhecimento do estudo de toxinas associadas à água e seus tratamentos; monitorar, através de técnicas já referenciadas para a análise desta molécula, a qualificação e a quantificação deste processo visando extrair informações que possam avaliar o processo degradativo dentro das condições propostas.

Materiais e equipamentos utilizados

Os padrões de microcistinas utilizados para montar uma mistura com as variantes foram adquiridos juntos às empresas Sigma-Aldrich (MC-LR), com pureza de 97,2% e Abraxis (MC-RR e MC-YR), com pureza maior que 95%, de lotes número: SZBF336XV, 300636 e 300638 respectivamente. Todos os padrões com concentração de aproximadamente 10 mg L^-1. Os solventes metanol (lote: I1144907 114) e acetonitrila (lote: JA085630), ambos de grau HPLC, foram obtidos com a empresa Merck Millipore. As soluções foram preparadas com água proveniente de um purificador de água Milli-Q modelo Integral 5 da marca Merck Millipore.

A metodologia por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e suas variantes configuracionais é a mais empregada para a detecção e quantificação de microcistinas.²⁹ O ensaio de HPLC para determinação de microcistinas em água já é normatizado pela norma ISO 20179:2005.³⁰ De acordo com Tillmanns et al.,³¹ dos 42 estudos publicados entre 2002 e 2006 sobre a análise de microcistinas em água, 14 utilizaram somente a técnica de HPLC e 17 a técnica de HPLC e outro ensaio. Utilizando apenas o método de HPLC para o ensaio de microcistinas em água é possível se obter resultados a nível de traços (μg L^-1) das toxinas analisadas.

No ensaio de HPLC para este experimento foi empregado o cromatógrafo líquido modular Ultimate 3000 da marca Thermo Scientific, com detector de arranjo de diodos e sistema de SPE (solid phase extraction) online que permite se realizar a concentração dos analitos e clean-up dos interferentes da matriz da amostra com posterior separação analítica.

A irradiação das amostras foi feita no Instituto de Defesa Química, Biológica, Radiológica e Nuclear (IDQBRN) do Centro Tecnológico do Exército (CTEx), em Guaratiba-RJ, em um irradiador gama com fonte de Cs¹³⁷.

Para o ensaio de espectrometria de massas foi utilizado o equipamento TSQ Fortis Plus da Thermo Scientific que possui uma fonte de ionização por eletrospray (ESI). O sistema analisador de massas é um triplo quadrupolo. O analisador de massas operou no modo SIM (single ion monitoring) que permite selecionar fragmentos específicos oriundos de uma quebra molecular.

A parte experimental por HPLC e espectroscopia de massas foram realizadas no Laboratório de Análises Minerais (LAMIN, RJ) da Companhia de Pesquisas de Recursos Minerais (CPRM), que realiza ensaios destas toxinas em água mineral por esta técnica.

O ensaio por HPLC-SPE online

Este método aplicado para o ensaio de microcistina-LR em cromatografia líquida visa a concentração, a separação, identificação e quantificação da mesma de uma mistura de microcistinas (RR, YR e LR). O método é proposto como uma metodologia rápida e eficiente para a análise de microcistinas em águas, que permite o uso de pequeno volume de amostra para concentração e análise em um mesmo equipamento, eliminando assim a etapa de concentração por extração em fase sólida tradicional que necessita de uma maior manipulação e está sujeita a perdas na recuperação dos analito fins. O sistema cromatográfico se descreve como um UPLC-SPE-ONLINE-DAD (ultra performance liquid chromatography - solid phase extraction online - diode array detection), e dispõe de um cromatógrafo líquido, configurado com um sistema de duas bombas quaternárias, uma bomba tipo standard e outro tipo ultra performance, amostrador automático com um loop de 2,5 mL, duas switches valve, detector UV-DAD, todo o sistema da marca Thermo Fisher. Os eluentes (E) utilizados são água ultrapura (El.D), solução de 0,015% v/v de TFA (ácido triflúoracético) (El.A), acetonitrila grau HPLC Lichrosolv Merck (El.C) e metanol Lichrosolv Merck (El.B). A etapa de concentração da amostra utiliza a bomba standard (bomba de carregamento) que realiza a injeção inicial da amostra, com um volume de 2,5 mL, um fluxo eluente de 0,5 mL min^-1 e constituído de um gradiente inicial de mistura composta de 20% de El.D, 20% de El.C mais 60% de El.A com uma rampa até 10 min com a composição de 40% de El.C e 60% de El.A, retornando a condição inicial de gradiente em uma rampa do 10º ao 15º minuto. Nesta etapa, a amostra é injetada em uma coluna Acclaim de fase C16 com 33 mm de comprimento, 3,0 mm de diâmetro interno e 3 μm de tamanho de partícula (coluna concentradora). Nesta coluna será realizada uma separação prévia dos interferentes da matriz da amostra e uma pré-concentração da mistura de microcistinas. Esta etapa se dá no intervalo de 0,00 até 10,20 min após a injeção da amostra.

A etapa de separação da mistura se dá em uma outra coluna da marca Acclaim Hipersil gold com fase C18 de comprimento de 100 mm, diâmetro interno de 2,1 mm e tamanho de partícula de 1,9 μm (coluna separadora), que por sua vez é condicionada com um fluxo de eluente bombeado por uma bomba UPLC (bomba analítica) na composição inicial de 35% do El.C, 5% de El.B e 60% do El.A no intervalo de tempo de 0 até 10 min de após a injeção da amostra.

No tempo de 10,2 min o fluxo da bomba de carregamento é desviado para o dreno enquanto o fluxo da bomba analítica é desviado para a coluna concentradora, removendo as microcistinas desta e as levando diretamente para a coluna separadora. Este desvio se dá por meio de um switch valve de 2 vias e 6 portas. No tempo de 10,2 min a bomba analítica inicia um gradiente até 18 min, cuja composição é de 60% do El.A e 40% do El.C, retornando à condição inicial em uma rampa de gradiente de 18 a 23 min. O cromatograma gerado na Figura 2, representa a separação entre as 3 variantes das microcistinas empregadas neste experimento.

Figura 2
Cromatograma com o pico de microcistina-LR e duas de suas variantes (RR e YR) na concentração de 10,0 µg L^-1

A confecção da curva analítica para a realização dos ensaios foi realizada com a mistura dos padrões de microcistinas nas seguintes concentrações: 0,5; 0,7; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 e 10,0 µg L^-1 com injeção em triplicata e padronização externa para quantificação.

Somente as soluções contendo o padrão de microcistina-LR na concentração de 9,0 μg L^-1 participaram do experimento com irradiação gama, que foi dividido em três partes. Uma parte das soluções foi irradiada com pH neutro, outra com pH 3-4 e a última com pH 8. As irradiações foram com as seguintes doses: 1,0; 3,0; 5,0; e 8,0 kGy para cada uma das três partes de soluções separadas. Algumas destas dosagens foram extraídas das literaturas referenciadas.³² As soluções com pH 3-4 foram acidificadas com uma solução 1:1 de HCl:H₂O e conduzidas para irradiação com as respectivas doses citadas anteriormente.

A outra parte das soluções foi levada à pH 8 com uma solução de NaOH 0,01 M e também conduzida para irradiação nas mesmas doses.

Todas as soluções tiveram amostras controles que não foram irradiadas. O pH foi mensurado com papel indicador universal.

Irradiação

Para a irradiação das soluções foi empregado o elemento Cs¹³⁷ como fonte, que tem meia vida de 30 anos e decai por emissão beta a um estado excitado para Ba¹³⁷. Um fóton gama é emitido quando os átomos de Ba¹³⁷ decaem para o estado fundamental. O tempo de meia vida desta fonte é elevado, o que permite sua utilização por longos períodos.³³

Após a inserção das amostras no irradiador, uma porta blindada é fechada, e a fonte é exposta de forma que a exposição da amostra se inicia no interior da câmara blindada (Figura 3). O operador pode permanecer na sala do irradiador. Um sistema de segurança mecânico e pneumático que monitora os movimentos da fonte inclui travas e microchaves, que elimina a possibilidade de exposição acidental à mesma, impedindo que a fonte de irradiação gama seja exposta enquanto a porta do irradiador estiver aberta. A Companhia Nacional de Energia Nuclear (CNEN) solicita levantamentos periódicos ao redor da instalação.

Figura 3
Irradiador gama com fonte de Cs¹³⁷ do IDQBN do CETEx em Guaratiba, RJ, onde as amostras foram irradiadas

Ensaio por espectrometria de massas

O espectrômetro de massas com uma fonte ESI operou no modo SIM com as seguintes configurações: voltagem capilar de 4.800 V, temperatura do vaporizador 150 °C, dwell time 300 ms, fonte de fragmentação de 30 V e fluxo de injeção 3,0 µL min^-1. O ensaio foi realizado por infusão direta com um fluxo de 3,0 µL min^-1.

O espectrômetro de massas operando no modo SIM possibilita uma flexibilização maior na identificação de fragmentos de massas provenientes da molécula principal que está sendo estudada. Esses fragmentos, no caso deste estudo e deste equipamento, foram gerados pelo processo denominado CID (collision-induced dissociation) onde a partir de configurações ajustadas de acordo com o método pode-se selecionar uma ou mais razões massa carga (m/z) específica.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A curva analítica gerada apresentou um coeficiente de determinação R² de 0,9998 e uma equação com y = 0,2036x + 0,0067 (Figura 4). O limite de quantificação foi calculado como LOQ = 10(Sb/a) onde Sb é a estimativa do desvio padrão do coeficiente linear da curva analítica utilizada e a o coeficiente angular da respectiva curva. Para o limite de detecção foi utilizada a relação LOD = 3,3(Sb/a).³⁴ O gráfico dos resíduos, feito a partir da curva analítica apresentada, mostra os pontos distribuídos de forma aleatória (Figura 5). Esta conjuntura indica que o modelo linear é satisfatório na representação da curva analítica, pois a variância dos erros é constante ao longo da faixa de trabalho da mesma. Esta condição é chamada de homoscedasticidade.³⁵

Figura 4
Curva analítica gerada para o analito microcistina-LR para o ensaio de cromatografia líquida

Figura 5
Gráfico de resíduos gerado a partir dos pontos da curva analítica para o método de análise da microcistina LR por HPLC

As soluções com o padrão de microcistina-LR irradiadas e não irradiadas em solução aquosa com pH neutro e com ajuste de pH (pH 3-4 e pH 8) foram colocadas para ensaio no método de HPLC utilizado.

A solução com o padrão de microcistina-LR com pH neutro e irradiada com 1,0 kGy apresentou uma redução da concentração inicial de microcistina LR de 88,05% em relação a sua concentração inicial (8,79 µg L^-1 → 1,05 µg L^-1).

Antes de ser irradiada, a solução com o padrão de microcistina-LR apresentou uma redução de 24,12 e de 29,24% deste analito em relação a sua concentração inicial após o ajuste para valores de pH 3-4 (8,79 µg L^-1 → 6,67 µg L^-1) e pH 8 (8,79 µg L^-1 → 6,22 µg L^-1), respectivamente.

A solução de microcistina-LR com pH 8 irradiada com dose de 1,0 kGy apresentou uma redução de 91,63% em relação à solução ajustada para pH 8 não irradiada (6,22 µg L^-1 → 0,52 µg L^-1), e uma redução de 94,08% em relação a sua concentração inicial antes do ajuste de pH (8,79 µg L^-1 → 0,52 µg L^-1), para um limite de quantificação calculado de 0,33 µg L^-1 e de detecção 0,11 µg L^-1 (Tabela 2).

Tabela 2
Resumo do balanço das concentrações com as dosagens de 1,0 kGy

Concentração antes da irradiação / (µg L-1)	Dosagem / kGy	Concentração final / (µg L-1)	Percentual de redução / %	Observação
8,79	1,0	1,05	88,05	sem alteração pH
6,22	1,0	0,52	91,63	pH8
6,67	1,0	< LOQ	-	pH 3-4

No estudo de Zhang et al.³² foi encontrada uma taxa de redução da concentração inicial de 93,77% para solução aquosa de microcistina-LR sem alteração de pH e irradiada com dose de 1,0 kGy (0,819 mg L^-1 → 0,051 mg L^-1) e de 98,8% para a dosagem de 8,0 kGy para concentrações na faixa de mg L^-1 (ppm).

Foi mensurado que a modificação da concentração de H⁺ ou OH^- produziu uma redução de massa de microcistina-LR nas soluções aquosas de pH 3-4 e pH 8 antes de serem irradiadas. No trabalho de Oliveira,³⁶ a condição de pH 3 foi a que propiciou maior redução na concentração de microcistinas em água.

A solução aquosa ajustada para pH 8 e irradiada com 1,0 kGy apresentou a redução mais acentuada da concentração de microcistina-LR em relação a sua concentração inicial. De acordo com Tauhata et al.,²⁰ a radiólise da água promove a formação do radical OH^•. Para um meio alcalino a condição do equilíbrio da radiólise na reação e^-_aq + OH^• → OH^- pode ser deslocada para o aumento da concentração das espécies reativas.

O ensaio com a metodologia de HPLC utilizando a técnica de SPE online se mostrou eficiente na separação da toxina microcistina-LR de suas variantes. As soluções contendo somente microcistina-LR irradiadas com as dosagens de 3,0; 5,0 e 8,0 kGy não apresentaram pico cromatográfico acima do limite de quantificação do método em nenhuma de suas variações, ou seja, solução de água com pH neutro, a pH 3-4 e a pH 8. O valor da concentração da molécula de microcistina-LR não ficou abaixo do valor máximo permitido (VMP) estabelecido pela OMS (Organização Mundial da Saúde)³⁷ e pela legislação brasileira³⁸ após a irradiação de 1,0 kGy.

A molécula de microcistina-LR possui diversos sítios suscetíveis de reação para um ataque ácido e básico. Portanto deve-se levar em consideração que a variação de pH vai atuar na protonação, desprotonação e no equilíbrio de cargas das moléculas de microcistinas. O ajuste desta condição analítica deve ser feito levando-se em conta o tipo de método que está sendo desenvolvido para a análise destas toxinas.

Todas as soluções irradiadas com a dose de 8,0 kGy também foram analisadas por infusão direta no espectrômetro de massas TSQ Fortis Plus com a intenção de se pesquisar a existência de traços representativos e característicos de fragmentação da molécula de microcistina LR³⁹,⁴⁰ após a dosagem de irradiação de mais alto valor (8,0 kGy) ter sido aplicada.

Os fragmentos selecionados no modo SIM do analisador de massas foram os seguintes: m/z 135; 213; 232; 498; 509 e 861, todos característicos da molécula de microcistina-LR.

Apesar da baixa intensidade dos espectros gerados, da ordem de 10^-2, têm-se um conjunto de picos que representam as relações m/z características da presença da molécula de microcistina-LR, indicando a presença desta molécula na solução. Os fragmentos m/z 232 e 135 referem-se diretamente ao grupo Adda da microcistina-LR, que é responsável pela atividade biológica desta toxina no fígado humano. Os outros fragmentos monitorados são resultados de rearranjos da abertura do anel da molécula, pois sua estrutura possui múltiplos sítios que possibilitam estas reações de fragmentação.

CONCLUSÕES

O método de HPLC utilizado juntamente com SPE online se mostrou eficiente na identificação, separação, detecção e quantificação da molécula de microcistina-LR na mistura de variantes de microcistinas. A variação de pH das soluções aquosas, contendo microcistina-LR, tanto para meio ácido como para meio alcalino, demonstrou uma redução da concentração inicial desta toxina - em torno de 25% - antes de serem irradiadas. A dosagem de 1,0 kGy não foi suficiente para reduzir a concentração de microcistina-LR abaixo do VMP pela legislação brasileira de 1,0 µg L^-1.

O ensaio por espectrometria de massas demonstrou a presença de fragmentos característicos da molécula de microcistina-LR após a irradiação de maior dosagem (8 kGy) demonstrando a permanência desta toxina em solução, porém abaixo dos limites estabelecidos pelas metodologias aplicadas para a sua detecção e quantificação.

Neste experimento, a irradiação gama demonstrou eficiência na degradação da toxina microcistina-LR. As técnicas analíticas utilizadas entregaram o resultado esperado no monitoramento deste processo que ainda enfrenta ceticismo e desconfiança por parte da sociedade. Diante deste cenário, mais estudos e a correta divulgação pertinente à esta técnica se faz necessária para conduzir esta conjuntura.

MATERIAL SUPLEMENTAR

O material suplementar contendo os cromatogramas com seus respectivos os espectros do detector e também os espectros de massas gerados no experimento estão disponíveis em: http://quimicanova.sbq.org.br, na forma de arquivo PDF, com acesso livre

Supplementary material 1

Supplementary material 1

DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS

Todos os dados estão disponíveis no texto.

REFERÊNCIAS

• ¹ de Castro, C. N.; Água, Problemas Complexos e o Plano Nacional de Segurança Hídrica; IPEA (Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada): Rio de Janeiro, 2022. [Crossref]
  » Crossref
• ² Freitas, P. Â. B.; de Araújo, S. M. S.; Revista Ibero-Americana de Ciências Ambientais 2021, 12, 606. [Crossref]
  » Crossref
• ³ Freire, L. L.; Souza Filho, F. A.; Eng. Sanit. Ambiental 2022, 27, 1155. [Crossref]
  » Crossref
• ⁴ van Apeldoorn, M. E.; van Egmond, H. P.; Speijers, G. J. A.; Bakker, G. J. I.; Mol. Nutr. Food Res. 2007, 51, 7. [Crossref]
  » Crossref
• ⁵ Dias, E.; Louro, H.; Pinto, M.; Santos, T.; Antunes, S.; Pereira, P.; Silva, M. J.; BioMed Res. Int. 2014, 2014, 949521. [Crossref]
  » Crossref
• ⁶ Park, H.-D.; Sasaki, Y.; Maruyama, T.; Yanagisawa, E.; Hiraishi, A.; Kato, K.; Environ. Toxicol. 2001, 16, 337. [Crossref]
  » Crossref
• ⁷ Schreidah, C. M.; Ratnayake, K.; Senarath, K.; Karunarathne, A.; Chem. Res. Toxicol. 2020, 33, 2225. [Crossref]
  » Crossref
• ⁸ Folcik, A. M.; Pillai, S. D.; Radiat. Phys. Chem. 2020, 177, 109128. [Crossref]
  » Crossref
• ⁹ Merel, S.; Walker, D.; Chicana, R.; Snyder, S.; Baurès, E.; Thomas, O.; Environ. Int. 2013, 59, 303. [Crossref]
  » Crossref
• ¹⁰ United States Environmental Protection Agency (U.S. EPA); Drinking Water Health Advisory for the Cyanobacterial Microcystin Toxins; U.S. EPA: Washington, 2015. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ¹¹ Díez-Quijada Jiménez, L.; Guzmán-Guillén, R.; Cătunescu, G. M.; Campos, A.; Vasconcelos, V.; Jos, Á.; Cameán, A. M.; Environ. Res. 2020, 185, 109284. [Crossref]
  » Crossref
• ¹² Sanches, S. M.; Vieira, E. M.; do Prado, E. L.; Benetti, F.; Takayanagui, A. M.; Ecletica Quim. 2007, 32, 43. [Crossref]
  » Crossref
• ¹³ Leal, A. C.; Soares, M. C. P.; Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 2004, 37, 84. [Crossref]
  » Crossref
• ¹⁴ Aoyama, H.; Silva, T. M. A.; Miranda, M. A.; Ferreira, C. V.; Quim. Nova 2003, 26, 896. [Crossref]
  » Crossref
• ¹⁵ Fontanillo, M.; Köhn, M.; Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 1118. [Crossref]
  » Crossref
• ¹⁶ International Atomic Energy Agency (IAEA); Radiation Treatment of Polluted Water and Wastewater; IAEA: Vienna, 2008. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ¹⁷ Rela, P. R.; Sampa, M. H. O.; Duarte, C. L.; Costa, F. E. D.; Rela, C. S.; Borrely, S. I.; Mori, M. N.; Somessari, E. S. R.; Silveira, C. G. Em Radiation Treatment of Polluted Water and Wastewater; IAEA: Vienna, 2008, p. 27. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ¹⁸ Aquino, S.; Lui, C. C.; Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 2017, 69, 1683. [Crossref]
  » Crossref
• ¹⁹ Harrell, C. R.; Djonov, V.; Fellabaum, C.; Volarevic, V.; Int. J. Med. Sci. 2018, 15, 274. [Crossref]
  » Crossref
• ²⁰ Tauhata, L.; Salati, I.; Di Prinzio, R.; Di Prinzio, A. R.; Radioproteção e Dosimetria: Fundamentos, 9ª revisão; Instituto de Radioproteção e Dosimetria/Comissão Nacional de Energia Nuclear (IRD/CNEN): Rio de Janeiro, 2013. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ²¹ International Atomic Energy Agency (IAEA); Gamma Irradiators for Radiation Processing; IAEA: Vienna, 2006. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ²² Stalter, R.; Howarth, D. Em Gamma Radiation; Adrovic, F., ed.; 2012, cap. 3. [Crossref]
  » Crossref
• ²³ Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) No. 21, de 26 de janeiro de 2001; Regulamento Técnico para Irradiação de Alimentos; ANVISA: Brasília, 2001. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ²⁴ Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Instrução Normativa - IN No. 44, de 21 de agosto de 2019, Dispõe sobre as Boas Práticas de Fabricação Complementares à Radiação Ionizante na Fabricação de Medicamentos; ANVISA: Brasília, 2019. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ²⁵ Levy, D.; Sordi, G. M. A. A.; Villavicencio, A. L. C. H.; Brazilian Journal of Radiation Science 2020, 8, 1. [Crossref]
  » Crossref
• ²⁶ Zong, W.; Sun, F.; Sun, X.; Water Res. 2013, 47, 3211. [Crossref]
  » Crossref
• ²⁷ Chang, J.; Chen, Z.; Wang, Z.; Kang, J.; Chen, Q.; Yuan, L.; Shen, J.; Chem. Eng. J. 2015, 276, 97. [Crossref]
  » Crossref
• ²⁸ Almeida, V. P. S.; Cogo, K.; Tsai, S. M.; Moon, D. H.; Braz. J. Microbiol. 2006, 37, 192. [Crossref]
  » Crossref
• ²⁹ Massey, I. Y.; Wu, P.; Wei, J.; Luo, J.; Ding, P.; Wei, H.; Yang, F.; Toxins 2020, 12, 641. [Crossref]
  » Crossref
• ³⁰ International Organization for Standardization (ISO); ISO 20179(E): Water Quality - Determination of Microcystins - Method Using Solid Phase Extraction (SPE) and High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) with UV Detection, 1^st ed.; ISO: Genebra, 2005. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ³¹ Tillmanns, A. R.; Pick, F. R.; Aranda-Rodriguez, R.; Environ. Toxicol. 2007, 22, 132. [Crossref]
  » Crossref
• ³² Zhang, J. B.; Zheng, Z.; Yang, G. J.; Zhao, Y. F.; Nucl. Instrum. Methods Phys. Res., Sect. A 2007, 580, 687. [Crossref]
  » Crossref
• ³³ Tokhy, H. H.; Elmaghraby, E. K.; Abdelhady, A. M.; Eid, A. M.; Rammah, Y. S.; Awad, E. M.; Abdelaal, S.; Radiochim. Acta 2021, 109, 407. [Crossref]
  » Crossref
• ³⁴ Ribani, M.; Bottoli, C. B. G.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F.; Melo, L. F. C.; Quim. Nova 2004, 27, 771. [Crossref]
  » Crossref
• ³⁵ Miller, J. N.; Miller, J. C.; Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 6^th ed.; Pearson: England, 2010, p. 285.
• ³⁶ de Oliveira, A. C. P.: Efeitos de Fatores Físicos, Químicos e Biológicos no Processo de Degradação e Remoção de Microcistinas; Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2003. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ³⁷ Background Documents for Development of WHO Guidelines for Drinking-Water Quality, 4^th ed. Incorporating the First and Second Addenda; World Health Organization (WHO). [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ³⁸ Ministério da Saúde; Portaria de Consolidação No. 5 de 28 de setembro de 2017, Consolidação das Normas sobre as Ações e os Serviços de Saúde do Sistema Único de Saúde, Anexo XX - do Controle e Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano e seu Padrão de Potabilidade; Ministério da Saúde, Brasília, p. 432. [Link] acessado em abril 2026
  » Link
• ³⁹ Diehnelt, C. W.; Dugan, N. R.; Peterman, S. M.; Budde, W. L.; Anal. Chem. 2006, 78, 501. [Crossref]
  » Crossref
• ⁴⁰ Bortoli, S.; Volmer, D. A.; Eur. J. Mass Spectrom. 2014, 20, 1. [Crossref]
  » Crossref

Editado por

• Editor Executivo responsável pelo artigo:
  Gustavo F. S. Andrade

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Maio 2026
• Data do Fascículo
  2026

Histórico

• Recebido
  20 Nov 2025
• Aceito
  31 Mar 2026
• Publicado
  09 Abr 2026