Efeito renoprotetor do Echinodorus macrophyllus na lesão renal induzida

Resumo

OBJETIVO:  Avaliar o efeito renoprotetor do Echinodorus macrophyllus na lesão renal aguda induzida pela ciclofosfamida em ratos.

MÉTODOS:  Pesquisa experimental com ratos Wistar, machos e adultos que foram distribuídos nos grupos: Controle - administração de 1,5 ml de cloreto de sódio a 0,9,% por via intraperitoneal, Echinodorous - administração de 2g/kg de Echinodorus macrophyllus por gavagem durante cinco dias, Ciclofosfamida - administração de ciclofosfamida 150mg/kg por via intraperitoneal, Ciclosfofamida + Echinodorus - administração de Echinodorus macrophyllus e ciclofosfamida. Foram avaliados a função renal (clearance de creatinina) e os metabólitos oxidativos (peróxidos e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico urinários, tióis no tecido renal).

RESULTADOS:  O pré-condicionamento com Echinodorus macrophyllus elevou o clearance de creatinina e reduziu os níveis dos metabólitos oxidativos.

CONCLUSÃO:  A ação antioxidante do Echinodorus macrophyllusdemonstrou efeito renoprotetor evidenciado pela redução do estresse oxidativo na lesão renal aguda induzida pela ciclofosfamida em ratos.

Pesquisa em enfermagem; Enfermagem prática; Lesão renal aguda; Antioxidantes; Alismataceae

Abstract

OBJECTIVE:  Evaluating the renoprotective effect of Echinodorus macrophyllusin acute kidney injury induced by cyclophosphamide in rats.

METHODS:  Experimental research with Wistar rats, male adults, distributed into groups, namely: Control - administration of 1.5 ml sodium chloride 0.9% intraperitoneally; Echinodorous - administration of 2g/kg of Echinodorus macrophyllus by gavage for five days; Cyclophosphamide - administration of cyclophosphamide 150mg/kg intraperitoneally; and Cyclosphosphamide + Echinodorus - administration of Echinodorus macrophyllus and cyclophosphamide. Renal function (creatinine clearance) and the oxidative metabolites (peroxides and urinary substances reactive to thiobarbituric acid, thiols in kidney tissue) were evaluated.

RESULTS:  Preconditioning with Echinodorus macrophyllus elevated the creatinine clearance and reduced the levels of oxidative metabolites.

CONCLUSION:  The antioxidant action of Echinodorus macrophyllus has demonstrated renoprotective effects evidenced by the reduction of oxidative stress in acute renal injury induced by cyclophosphamide in rats.

Nursing research; Practice nursing; Acute kidney injury; Antioxidants; Alismataceae

Introdução

A utilização de plantas medicinais é notória nos últimos anos, devido aos seus efeitos potencialmente benéficos à saúde humana, no entanto, ainda existe uma carência de informação sobre seus efeitos mutagênicos na maioria dos princípios ativos.^{( 1 )}

Em particular, nas regiões tropicais existe uma diversidade de espécies de plantas medicinais que são utilizadas pela população para o tratamento de suas doenças. As plantas medicinais são utilizadas para várias finalidades e baseadas em evidências históricas ou pessoais que foram incorporadas por hábitos, tradições ou costumes ao longo do tempo, porém estudos que comprovem segurança e eficácia ainda são raros.^{( 2 )}

A carência de pesquisas científicas para plantas nativas brasileiras compromete a divulgação desses produtos e acarreta em dificuldades para o seu aproveitamento como matéria-prima pela indústria de fitomedicamentos. Nesse contexto, podemos citar a espécie nativa brasileira Echinodorus macrophyllus da família Alismataceae, conhecida vulgarmente por chapéu-de-couro, chá-mineiro, erva-de-pântano, erva-de-bugre, congonha-do-campo ou erva-do-brejo, amplamente utilizada na medicina popular nas regiões sudeste e centro oeste. Suas folhas são utilizadas para o tratamento de várias enfermidades, como reumatismo e sífilis.^{( 3 )} O Echinodorus macrophyllus é conhecido por sua ação diurética, e possui propriedades anti-inflamatória e antioxidante.^{( 3 )}

Atualmente, as plantas medicinais são reconhecidas como potentes antioxidantes e utilizados principalmente em pesquisas experimentais para prevenção ou tratamento de lesões celulares induzidas pelo desequilíbrio entre enzimas antioxidantes e oxidantes.⁽²⁾ Na prática clínica, o uso de medicamentos frequentemente resultam em lesão das células renais que caracteriza o quadro de lesão renal aguda (LRA) com rápido declínio da função renal, definida clinicamente por um aumento absoluto da creatinina sérica de pelo menos 0,3mg/dl ou a elevação de 1,5 vezes do valor basal ou a redução do fluxo urinário, documentado como oligúria ou menor que 0,5ml/kg por hora por mais de seis horas.^{( 4 )}

A lesão renal aguda é uma complicação em 5% das hospitalizações e até 30% das internações em unidade de terapia intensiva.⁽⁵⁾ Os medicamentos que apresentam potencial nefrotóxico são responsáveis por aproximadamente 20% dos casos de lesão renal aguda em pacientes críticos.^{( 6 )} Exemplos incluem antimicrobianos, quimioterápicos, analgésicos e imunossupressores.^{( 7 )}

Destaca-se entre os quimioterápicos a ciclofosfamida, um agente citostático, empregado no tratamento de doenças neoplásicas de tumores sólidos e linfomas e outras doenças não neoplásicas, como a artrite reumatoide e o lúpus eritematoso sistêmico. Esse medicamento e seus metabólitos podem causar nefrotoxicidade com disfunção glomerular e tubular.^{( 8 )} Os modelos de estudos in vivo demonstraram que durante a administração de ciclofosfamida foi constatada a diminuição da reserva antioxidantes no plasma e no tecido renal dos animais.^{( 8 , 9 )}

As características anatômicas e funcionais do rim favorecem a incidência de lesão renal aguda de origem nefrotóxica, visto que 25% do débito cardíaco são direcionados para o órgão e o alto fluxo sanguíneo renal favorece a alta concentração de substâncias tóxicas e seus metabólitos no tecido. Além de que as células do túbulo proximal e da alça de Henle apresentam maior sensibilidade à lesão induzida por substâncias nefrotóxicas devido a sua localização em um ambiente hipóxico da porção externa da medula renal e essas células necessitam de altas concentrações de energia para o transporte ativo de solutos.^{( 7 )} A fisiopatologia da lesão renal aguda é composta por vários mecanismos como a disfunção da microvasculatura renal que reduz o ritmo de filtração glomerular, a toxicidade tubular direta que desencadeia intensa resposta inflamatória e a geração espécies reativas de oxigênio.^{( 10 )}

Considerando o efeito nefrotóxico da ciclofosfamida e a sua indicação para o tratamento de diversas neoplasias e em outras doenças, este estudo tem como objetivo verificar o efeito protetor do Echinodorus macrophyllus na lesão renal aguda induzida pela ciclofosfamida em ratos.

Métodos

Estudo experimental em modelo animal. Foram utilizados ratos da raça Wistar, machos, adultos, de 250 a 300 gramas que foram distribuídos nos seguintes grupos:

- Controle - os animais que receberam solução de cloreto de sódio a 0,9% por via intraperitoneal (i.p.), dose única;

- Echinodorus - os animais que receberam uma solução de Echinodorus macrophyllus (2g/kg) por gavagem, uma vez ao dia, durante cinco dias;

- Ciclofosfamida - os animais que receberam ciclofosfamida (150mg/kg) por via intraperitoneal, dose única;

- Ciclofosfamida + Echinodorus - animais que receberam Echinodorus macrophyllus (2g/kg) por gavagem, uma vez ao dia, durante 5 dias e a ciclofosfamida (150mg/kg) por via intraperitoneal, dose única no quinto dia do experimento.

Ao final do protocolo, os animais foram colocados em gaiolas metabólicas individuais para e coleta de urina de 24 horas para avaliação da função renal e de metabólitos oxidativos. Após esse período, os animais foram anestesiados para a coleta de sangue terminal por meio da punção da aorta abdominal e posterior avaliação da função renal.

A função renal foi avaliada por meio do clearance de creatinina. O método colorimétrico de Jaffé foi utilizado para determinar os valores da creatinina sérica e urinária. O clearance de creatinina foi calculado pela fórmula: clearance de creatinina = creatinina urinária x fluxo urinário de 24horas / creatinina sérica.^{( 11 , 12 )}

Os metabólitos oxidativos foram avaliados por meio da dosagem de peróxidos urinários, de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e de tióis no tecido renal. A avaliação de peróxidos urinários foi realizada pelo método FOX-2, a utilização de ferro-xilenol laranja que oxida o íon Fe²⁺ e produzindo um complexo de coloração azul-arroxeado (α= 4,3 x 10⁴ M^-1 cm^-1).^{( 11 , 12 )} A avaliação de TBARS urinários permite a identificação de produtos finais da cascata de peroxidação lipídica que reagem na presença do ácido tiobarbitúrico em fluídos orgânicos (α= 1,56 x 10⁵ M^-1cm^-1).^(11,12) O nível de tióis no tecido renal foi avaliado por meio da reação com DTNB (α= 13,6 x 10³ M^-1 cm^-1).^{( 11 )}

Os resultados foram apresentados em média±desvio padrão. A análise estatística dos resultados foi realizada pela análise de variância ANOVA, seguida pelo teste de Tukey para comparações entre os grupos. O nível de significância considerado foi de p<0,05.

O desenvolvimento do estudo atendeu as normas nacionais e internacionais de ética em pesquisa envolvendo o uso de animais.

Resultados

Conforme demonstrado na tabela 1, os grupos Controle e Echinodorus não apresentaram variabilidade em relação ao clearance de creatinina. A administração da dose única de ciclofosfamida resultou em redução significativa do clearance de creatinina que caracterizou o modelo de LRA nefrotóxica (p<0,001). Observou-se que o pré-condicionamento com Echinodorus macrophyllus em animais tratados com ciclofosfamida a apresentaram elevação significativa do clearance de creatinina quando comparados com o grupo Ciclofosfamida (p<0,05).

Tabela 1
Resultados da função renal dos diversos grupos

Grupos	n	Peso (gramas)	Fluxo urinário (ml/min)	Clearance de creatinina/100g (ml/min)
Controle	5	280±28	0,013±0,003	0,81±0,05
Echinodorus	6	290±11	0,011±0,002	0,77±0,14
Ciclofosfamida	11	286±14	0,016±0,005	0,20±0,05ab
Ciclofosfamida+Echinodorus	11	293±21	0,011±0,004	0,31±0,11abc

• ^a
  p < 0,001versus Controle
• ^b
  p < 0,001versus Echinodorus
• ^c
  p < 0,05 versus Ciclofosfamida

Os resultados dos metabólitos oxidativos (Tabela 2) demonstraram que os valores de peróxidos urinários dos grupos Controle e Echinodorus foram considerados como referência de normalidade. Sendo que o grupo Ciclofosfamida apresentou elevação significante dos valores de peróxidos urinários quando comparados com os grupos controle (p<0,001). O grupo que recebeu o tratamento com Echinodorus macrophyllus apresentou redução da excreção de peróxidos urinários em relação ao grupo Ciclofosfamida (p<0,05).

Tabela 2
Resultados dos metabólitos oxidativos dos diversos grupos

Grupos	n	Peróxidos urinários (nmol/g de creatinina)	TBARS urinários (nmol/g de creatinina urinária)	Tióis no tecido renal (nmol/mg de proteínas)
Controle	5	25,6±6,5	0,3±0,1	_
Echinodorus	6	27,0±7,3	0,3±0,1	2,1±0,2
Ciclofosfamida	11	73,9±24,0ab	4,6±1,9ab	1,2±0,4a
Ciclofosfamida+Echinodorus	11	47,7±20,2abc	1,3±1,0abc	2,4±0,4c

• ^TBARS
  - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
• ^a
  p < 0,001 versus Controle
• ^b
  p < 0,001 versus Echinodorus
• ^c
  p < 0,05 versus Ciclofosfamida

A quantificação de TBARS urinários seguiu o padrão descrito para os peróxidos urinários. O grupo Ciclofosfamida apresentou elevação significante de TBARS quando comparado com os grupos Controle e Echinodorus (p<0,001). O grupo Ciclofosfamida+Echinodorus apresentou redução estatisticamente significante de TBARS em relação ao grupo Ciclofosfamida (p<0,05).

A avaliação de tióis no tecido renal demonstrou que o grupo Ciclofosfamida apresentou redução dos níveis de tióis no tecido renal quando comparado com o grupo Echinodorus (p<0,001) e o pré-condicionamento com Echinodorus macrophyllus aumentou significativamente os níveis de tióis no tecido renal na comparação com o grupo Ciclofosfamida (p<0,05).

Discussão

Este estudou demonstrou que o pré-condicionamento com Echinodorus macrophyllus atenuou a lesão renal aguda induzida pela ciclofosfamida em ratos que foi evidenciado pelo aumento do clearance de creatinina e redução dos metabólitos oxidativos na urina e aumento da reserva de enzimas antioxidantes no tecido renal. No entanto, o estudo apresenta limitações em relação à extração do Echinodorus macrophyllus, visto que não foi realizada uma quantificação específica dos componentes funcionais da planta. Porém, os resultados desse estudo permitem identificar o mecanismo de toxicidade via geração de espécies reativas de oxigênio no modelo de lesão renal aguda induzida pela ciclofosfamida.

Esses dados permitem o enfermeiro identificar a ciclosfosfamida como um medicamento com potencial para nefrotoxicidade e estratificar os pacientes de risco para implementar medidas preventivas como a hidratação e a administração de fármacos antioxidantes. Essa prática pode ser evidenciado por meio de protocolos assistenciais com n-acetilcisteina para profilaxia da nefrotoxidade induzidas por radioconstrate iodado.^{( 13 )}

Clinicamente, a toxicidade da ciclofosfamida apresenta efeitos adversos leves como os sintomas urinários irritativos e transitórios, leve hematúria e quadro mais graves como a lesão renal aguda.⁽¹⁴⁾ O objetivo principal das terapias de prevenção de efeitos adversos é a manutenção da eficácia do tratamento medicamentoso e o uso de protetores que demonstrem inibição ou interferência em mecanismos patológicos de lesão celular.^{( 14 )} As estratégias para prevenção de efeitos adversos da ciclofosfamida são bem vindas e se destacam os agentes antioxidantes como os flavonoides, Echinodorus macrophyllus.

A ciclofosfamida e o seu análogo estrutural, ifosfamida, são largamente utilizado em protocolos terapêuticos para pacientes com neoplasias e também para condições não neoplásicas. A toxicidade da ciclofosfamida está relacionada principalmente com a liberação de metabólitos tóxicos pelo fígado, o citocromo P-450, que converte a ciclofosfamida em acroleina e cloroacetaldeído. Nos rins, a acroleina e cloroacetaldeído causam morte das células do epitélio tubular. O mecanismo tóxico primário envolve ação direta da acroleina no túbulo proximal, e a ação secundária da aldofosfamida - compostos nitrogenados tóxicos e alquilantes - são responsáveis pela geração de espécies reativas de oxigênio.^{( 15 , 16 )} Essa metabolização da ciclofosfamida induz a liberação de citocinas inflamatórias e a geração de espécies reativas de oxigênio que resultam em peroxidação lipídica da membrana celular e consequente, lesão renal.^{( 15 , 16 )}

Dessa forma, a administração do quimioterápico ciclofosfamida induziu a LRA em ratos que foi caracterizada pela redução da taxa de filtração glomerular, evidenciada pela redução do clearance de creatinina. A liberação metabólitos oxidativos confirma o mecanismo de lesão tubular, como o radical superoxido e hidroxila e de intermediários, como os peróxidos, que resulta no consumo da reserva de antioxidantes. Estudos realizados com diferentes medicamentos nefrotóxicos, como a gentamicina, os radiocontrastes e outros quimioterápicos reforçam o significativo papel da lesão oxidativa na lesão renal aguda nefrotóxica.^{( 12 , 16 - 18 )}

Os antioxidantes são compostos que atenuam ou inibem a oxidação de proteínas celulares, a peroxidação de lipídios da membrana celular e lesão de ácidos nucleicos.^{( 7 )} Neste cenário surgem às plantas medicinais que contêm flavonoides, utilizadas há milhares de anos na medicina oriental, possuem atividade antioxidante e função protetora no tratamento de doenças mediadas por espécies reativas de oxigênio.^{( 19 , 20 )} Destaca-se a Echinodorus macrophyllus, descrita pela sua ação antioxidante e anti-inflamatória, rica em flavonoides, confirmada por análise fitoquímica de suas folhas.^{( 19 )}

Nesse contexto, observou-se que ação antioxidante do fitomedicamento Echinodorus macrophyllus atenuou a redução da função renal e redução significativa dos níveis de peróxidos e de aldeídos provenientes da peroxidação lipídica. Resultados semelhantes de proteção antioxidante da Echinodorus macrophyllus foram encontrados em estudos realizados em modelo de lesão renal aguda induzida pela gentamicina.^{( 17 )} A administração de flavonoides demonstrou efeito protetor na nefrotoxicidade induzida pela cisplatina em ratos com elevação do clearance de creatinina, redução de peroxidação lipídica e de mediadores inflamatórios.⁽²⁰⁾ Resultado semelhante foi demonstrado em estudo realizado com o fitoterápico Uncaria tomentosa em modelo de lesão renal aguda isquêmica.⁽²¹⁾

Estudos com fitomedicamentos têm evoluído nas últimas décadas, na tentativa de contribuir para o tratamento de doenças crônicas e agudas. Embora ainda haja necessidade de investigações sobre os efeitos adversos do Echinodorus macrophyllus para sua introdução definitiva na prática clínica, os mecanismos antioxidantes protetores desse fitomedicamento o insere como possível alternativa de tratamento de prevenção da LRA nefrotóxica.

Esta pesquisa possibilitará à enfermagem correlacionar à pesquisa básica à clínica e permite ao profissional uma compreensão mais aprimorada dos mecanismos fisiológicos e patológicos que acometem a lesão renal aguda nefrotóxica pela ciclofosfamida.

Conclusão

O efeito antioxidante da Echinodorus macrophyllus promoveu renoproteção funcional evidenciado pelo aumento do clearance de creatinina e redução de metabólitos oxidativos no modelo de lesão renal aguda induzida pela ciclofosfamida em ratos.

Agradecimentos

Pesquisa realizada com o apoio da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP. Projeto FAPESP: 2010/02155-3.

Referências bibliográficas

• ¹ Vidal LS, Alves AM, Kuster RM, Lage C, Leitão, AC. Genotoxicity and mutagenicity of Echinodorus macrophyllus (chapéu-de-couro) extracts. Genet Mol Biol. 2010; 33(3):549-57.
• ² Silveira PF, Bandeira MA, Arraia PS. [Pharmacovigilance and adverse reactions to the medicinal plants and herbal drugs: a reality.] Rev Bras Farmacogn. 2008; 18(4):618-26. Portuguese.
• ³ Leite JP, Pimenta DS, Gomes RS, Dantas-Barros AM. Contribuição ao estudo farmacobotânico da Echinodorus macrophyllus (Kunth) Micheli (chapéu-de-couro) - Alismataceae. Rev Bras Farmacogn. 2007; 17(2):242-8.
• ⁴ Mehta RL, Kellum JA, Shah SV, Molitoris BA, Ronco C, Warnock DG, et al. Acute kidney Injury Network: report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury. Crit Care. 2007; 11(2):R31.
• ⁵ Hoste EA, Shurgers M. Epidemiology of acute kidney injury: how big is the problem? Crit Care Med. 2008; 36(4 Suppl):S146-51.
• ⁶ Dennen P, Douglas IS, Anderson R. Acute kidney injury in the intensive care unit: an update and primer for the intensivist. Crit Care Med. 2010; 38(1):261-75.
• ⁷ Perazella MA. Renal Vulnerability to Drug Toxicity. Clin J Am Soc Nephrol. 2009; 4(7):1275-83.
• ⁸ Sinanoglu O, Yener AN, Ekici S, Mid A, Aksungar FB. The Protective effects of spirulina in cyclophosphamide induced nephrotoxicity and urotoxicity in rats. Urology. 2012; 80(6):1392. e1-6.
• ⁹ Sugumar E, Kanakasabapathy I, Abraham P. Normal plasma creatinine level despite histological evidence of damage and increased oxidative stress in the kidneys of cyclophosphamide treated rats. Clin Chim Acta. 2007; 376(1-2):244-5.
• ¹⁰ Sing AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K et al. Animal models of acute renal failure. Pharmacol Res. 2012; 64(1):31-44.
• ¹¹ Dezoti DF, Watanabe M, Vattimo MFF. Role of heme oxygenase-1 in polymyxin B-induced nephrotoxicity in rats. Antimicrob Agents Chemother. 2012; 56(10):5082-7.
• ¹² Pinto CF, Watanabe M, Vattimo MFF. Hydration and N-acetylcysteine in acute renal failure caused by iodinate medium: an experiment with rats. J Nephrol. 2008; 21(5):783-8.
• ¹³ Wood SP. Contrast-induced nephropathy in critical care. Crit Care Nurse. 2012; 32(6):15-24.
• ¹⁴ Lawson M, Vasiliaras A, De Vries A, Taggart PM, Nicol D. Urological implications of cyclophosphamide and ifosfamide. Scand J Urol Nephrol. 2008; 42(4):309-17.
• ¹⁵ Sayed-Ahmed MM. Progression of cyclophosphamide-induced acute renal metabolic demage in carnitine-depleted rat model. Clin Exp Nephrol. 2010; 14(5):418-26.
• ¹⁶ Korkmaz A, Topal T, Oter S. Pathophysiological aspects of cyclophosphamide and ifosfamide induced hemorrhagic cystitis; implication of reactive oxygen and nitrogen species as well as PARP activation. Cell Biol Toxicol. 2007;23(5):303-12.
• ¹⁷ Portella VG, Cosenza GP, Diniz LRL, Pacheco LF, Cassali GD, Caliari MV et al. Nephroprotective Effect of Echinodorus Macrophyllus Micheli on Gentamicin-Induced Nephrotoxicity in Rats. Nephron Extra. 2012;2(1):177-83.
• ¹⁸ Zhang J, Lu H. Ifosfamide induces acute renal failure via inhibition of the thioredoxin reductase activity. Free Radic Bio Med. 2007; 43(12):1574-83.
• ¹⁹ Tanus-Rangel E, Santos SR, Lima JCS, Lopes L et AL. Topical and Systemic anti-Inflammatory Effect of Echinodorus macrophyllus (Kunt) Micheli (Alismataceae). J M Food. 2010; 13(5):1161-6.
• ²⁰ Kuhad A, Pilkhwal S, Sharma S et al. Effect of curcumin on inflammation and oxidative stress in cisplatin-induced experimental nephrotoxicity. J Agric Food Chem. 2007; 55(25):10150-5.
• ²¹ Vattimo MF, Silva NO. Uncaria tomentosa and acute ischemic kidney injury in rats. Rev Esc Enferm USP. 2011; 45(1): 194-8.

• Colaborações Nascimento EL; Watanabe M; Fonseca CD; Schlottfeldt FS e Vattimo MFF declaram que contribuíram com a concepção do projeto, análise e interpretação dos dados, redação do artigo, revisão crítica relevante do conteúdo intelectual e aprovação final da versão a ser publicada.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2014

Histórico

• Recebido
  20 Jan 2014
• Aceito
  26 Fev 2014