NOVOS TESTES DE CULTIVO DE FUNGOS UTILIZADOS EM CONTROLE BIOLÓGICO USANDO MEIOS DE CULTURA NATURAIS LÍQUIDOSRESUMO
O estudo foi realizado com o objetivo de comparar o desenvolvimento e a esporulação dos fungos
Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin), Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Hansfordia pulvinata (Berk & Curt.) Hughes, em meios de cultura obtidos por maceração de sementes de três variedades de feijão de mesa (Carioca, Carioca 80 e Jalo) e de feijão Guandú, soja e grão de bico. Os substratos foram obtidos usando 50 g de matéria prima para 500ml de água destilada. A esterilização foi feita em autoclave por 30 minutos.
Foi constatado que os fungos M. anisopliae e B. bassiana alcançaram maiores índices de esporulação que H. pulvinata em GuandÚ e grão de bico. Carioca 80 ofereceu boa produtividade de conídios para os três fungos. Jalo teve destaque somente para H. pulvinata.
PALAVRAS-CHAVE
Metarhizium anisopliae; Beauveria bassiana; Hansfordia pulvinata; meios de cultura; feijão; feijão guandú; soja; grão de bico.
SUMMARY
The study was done in order to compare the development and spores production of the fungi Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. and Hansfordia pulvinata ((Berk. & Curt.) Hughes), in culture media obtained by macerated grains of 3 kinds of table bean (Carioca, Carioca 80, Jalo), Guandú bean, soybean and chick-pea. The substrates were obtained through the use of 50g of grains for 500mI of destilated water. The sterilization was done in autoclave by
30 minute'.
It was evidenced that the fungus M. anisopliae and B. bassiana reached higher index of sporulation than H. pulvinata in Guandú bean and chick-pea. Carioca 80 also offered excelent spore productivity for the 3 fungus. Jalo had eminence only for H. pulvinata.
KEY-WORDS
Metarhizium anisopliae; Beauveña bassiana; Hansfordia pulvinata; culture media; bean; guandú, bean; soybean:; chik-pea.
INTRODUÇÃO
O uso de fungos entomo e micopatogênicos, no controle bioló$co de pragas e doenças das plantas econômicas, vêm aumentando significativamente nos últimos anos (1,4,5,8,11,12), face aos problemas inerentes ao uso de defensivos químicos, principalmente sob o ponto de vista de resíduos e de desiquilffrio bioló$co.
No entanto, para que tais agentes possam ser utilizados, em larga escala, é necessário que se tenha alta produção desses microrganismos. Em virtude desse fato, justifica-se o interesse pelos estudos que buscam encontrar meios de cultura que viabilizem esse objetivo. Tais meios de cultura, para serem adequados, devem ser de baixo custo, de fácil preparo e eficientes quanto ao desenvolvimento e esporulação de microrganismos de interesse objetivo. Além disso, procuram-se também, tipos de forrnulaçóes que tornem mais prática a utilização desses inseticidas/fungicidas bioló$cos no campo.
Diversos pesquisadores tem desenvolvido estudos relativos ao preparo dos mais variados meios de cultura, sendo bastante enfatizados, ultimamente, aqueles que tem características naturais e que possam ser obtidos com facilidade e a preços reduzidos. Nesses estudos, duas linhas básicas tem sido adotadas com sucesso, quais sejam, usando meios de culturas sólidos (2, 3, 7, 10, 11) ou meios de cultura líquidos, obtidos por maceração de grãos (6, 9, 10).
No presente trabalho, procurou-se dar continuidade à linha de pesquisa estabelecida na Seção de Controle Biológico das Pragas- SCBP, com vistas ao estudo de meios de cultura naturais líquidos, que favoreçam a esporulação dos fungos entomopatogênicos: Metarhizium anisopliae [(Metsch.) Sorokinj e Beauveria bassiana [(Bals.) Vuill Complementarmente, foi também verificada a eficácia desses mesmos meios para o desenvolvimento e produção de esporos do fungo micopatogênico Hansfordia pulvinata [ (Berk. e Curt.) Hughes].
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado observando-se o desenvolvimento e a esporulação dos fungos em seis meios de cultura líquidos (macerados de grãos), obtidos a partir de sementes de três variedades de feijão de mesa (Carioca, Carioca 80 e Jalo) e feijão Guandú (Kaqui), soja (IAC-8) e grão de bico (Comercial). Os meios de cultura foram obtidos a partir do cozimento de 50 gramas das sementes em 500ml de água destilada, sob pressão, por 20 minutos. Após o cozünento, as sementes foram amassadas e passadas em peneira comum de cozinha, recolhendo-se o resíduo. Esse resíduo foi juntado à água de fervura, sendo o volume completado para 500ml pela adição de água destilada. Os caldos foram distribuí dos em frascos de vidro, com volume de 50ml; tamponados com algodão. Cada frasco continha 10ml de macerado. Os frascos foram então autoclavados por 40 minutos, a 120°C.
Nos meios de cultura assim preparados foram estudados os seguintes fungos:
I - Metarhizium anisopliae: cultura n. 0 24 da micoteca da SCBP, isolada de "bicudo do algodoeiro" (Anthonomus grandis Boheman 1843), recebida do Departamento de Entomologia da Escola Superior de Agriculturp "Luiz de Queros" (ESALQ/USP) referência SPL-358;
II - Beauveria bassiana: cultura n.o23 da micoteca da SCBP, isolada de "bicudo do algodoeiro" ,
III - Hansfordia pulvinata: cultura n.o65 da micoteca da SCBP, isolada de frutificações de Mecrocyclus ulei (P. Henn.) v. Arx, recebida do Centro Nacional de Pesquisa da Seringueira e Dendê )EMBRAPA).
A execução do estudo foi feita em 3 etapas, ou seja, com um fungo por vez. Cada etapa foi precedida pelo preparo das matrizes fornecedoras de inóculo e que eram constituídas por culturas em meio de arroz úmido autoclavado. A idade das matrizes esteve sempre ao redor de 15 dias. A operação de repicagem dos fungos foi uniformizada e consistia na introdução de um grão de arroz recoberto de esporos e micélio, no meio de cultura de cada frasco. Foram considerados 7 frascos (repetições) por meio de cultura, para cada microrganismo. Após as inoculações, os frascos eram levados a uma sala de incubação e crescirnento, cuja temperatura ambiente permanecia ao redor de 28°C, com umidade relativa do ar próxima de 65% e luminosidade de 8 horas contínuas/dia. Decorrido o tempo necessário para que os fungos colonizassem o meio de cultura e evidenciassem aparente paralização do processo de esporulação, os frascos eram colocados em geladeira a 3 oc, no aguardo da leitura para avaliar os totais' de confdios formados. A concentração de esporos foi calculada utilizando-se uma Câmara de Newbauer, observando-se ao microscópio com aumento de 400x. Para o preparo das suspensões, submetidas à contagem do número de esporos, foram procedidas diluições de acordo com o seguinte critério: aos frascos originais de cultura foram adicionados 10ml de água destilada estéril, fazendo-se, a seguir, uma agitação intensa por 2 s minutos, seguindo-se sua colocação em um agitador orbital durante o período de 2 horas. De cada frasco então foram retiradas 5 amostras de lml, às quais foram incorporados 5ml de água destilada. Essas 5 diluições eram agitadas manualmente por 1 minuto e a seguir passadas para a Câmara de Newbauer.
As datas das operações realizadas no estudo dos três fungos foram as seguintes:
Para efeito da análise da variância conjunta, os dados referentes ao número de conídios foram transformados em , aplicando-se o teste de Tukey para os contrastes de médias, adotando-se o ñl'vel de significância de 5% de probabilidade. O valor de x foi obtido por média de 60 observações, compostas por 5 lâminas observadas em dois níveis e em cinco campos por nível.
RESULTADOS
A análise estatística conjunta dos três ensaios acusou coeficiente de variação de 13,3%, o que demonstra boa precisão técnica na condução dos experimentos.
Resumo da análise de variância conjunta realizada com vistas ao estudo da esporulação dos fungos M. anisopliae, B. bassiana e H. pulvinata, em 6 meios de cultura naturais líquidos.
Verificou-se através da significância da interação dos meios de cultura/fungos, a necessidade de se avaliar o comportamento de cada fungo dentro de cada variedade de feijão e vice-versa.
Esta avaliação é apresentada na tabela 2, sendo que os contrastes de médias, pelo teste de Tukey, basearam-se nas seguintes diferenças mínimas significativas: fungos dentro dos meios: 0,3; meios dentro de fungos: 0,5.
DISCUSSÃO
Será examinado, inicialmente, o comportamento dos fungos entomopatogênicos. A análise estatística mostrou, para M. anisopliae, que o meio de cultura de macerado de guandú foi melhor que os de grão de bico e de carioca 80. Estes, por sua vez, apresentaram respostas semelhantes e superiores aos dos 3 demais, os piores, que não se diferenciaram entre si. Em relação a B. bassiana, a análise acusou maiores variações, sendo o meio guandú superior, estatisticamente, ao de grão de bico e, este, ao de Carioca 80. Carioca, Jalo e Soja continuaram formando um grupo homogêneo e inferior. Para H. pulvinata, a análise estatística acusou a presença de três grupos de reação, quais sejam: Carioca 80, Jalo e Guandú, os melhores, seguindo-se, em posição intermediária e isolado o Carioca, e ficando por último, grão de bico e soja.
Número médio de comídios dos fungos M. anisopliae, B. bassiana e H. pulvinata nos meios de cultura líquidos naturais à base de feijão de mesa (Carioca, carioca 80 e jalo), soja, grão de bico e guandú.
Valores da esporulação média por ml obtida para os fungos M. anisopliae, B. bassiana e H. pulvinata, em testes de crescimento em meios de cultura líquidos à'base de feijões de mesa (Carioca 80, carioca e jalo), soja, guandú e grão de bico.
De outra parte, quando se examinarn os efeitos considerando cada tipo de substrato em relação aos microrganismos, chama a atenção o fato de que para os dois fungos entomopatogênicos, os substratos de grão de bico e de Guandú, foram os mais destacados, principalmente o de Guandú. Carioca 80 teve também bom comportamento. Para H. pubinata, onde o grão de bico foi mal e o Guandú muito bem, houve bom comportamento para Carioca 80 e Jalo. Frize-se que este último, mostrou-se fraco com vistas aos dois entomopatógenos.
No que se refere à produção de conídios, deve ser lembrado que ela esteve sempre na ordem de 109 esporos/inl. As maiores produções estiveram com B. bassüna em Guandú (1 ,8x109) e M. anisopliae em Guandú (1 ,5x109) e grão de bico (1 ,1x109). Para H. Pulvinata a esporulação máxima chegou a 0,7x109 , inferior, portanto, aos melhores índices dos dois entomopatógenos.
Deve ser, finalmente, ressaltado, que no presente estudo, foram constatados, respectivamente, para M. anisopliae cultivado em macerado de feiião Carioca 80 e de Carioca: 0,7x109 e 0,2x 109 esporos/ml. Tais resultados, a despeito de elevados, são inferiores ao observado em pesquisa anterior realizada na Seção de Controle Biológco das Pragas (10), quando foi conseguido 12,5x10 10 esporos/ml, na produção massal do microrganismo em garrafas de 500ml. Em outra ocasião (9), o valor obtido chegou a 6,85x108 . Em ambos os casos o feijão utilizado foi Carioca proveniente do comércio local.
Quanto ao fungo B. bassiana, cultivado em Carioca 80 e Carioca, que produziu, respectivamente: 0,5x109 e 0,2x109 esporos/ml, tais valores superaram ao constatado em trabalho anterior (6), quando a esporulação em macerado de feijão Carioca comercial ultrapassou 5x108 conídios/ml.
CONCLUSÕES
As principais conclusões obtidas no estudo foram:
1) A esporulação dos fungos M. anisopliae, B. bassiana e H. pulvinata nos 6 tipos diferentes de macerado ofereceu consideráveis variações;
2) O meio de cultura à base de feijão Guandú foi o único que favoreceu esporulação máxima para os 3 fungos. O feijão Carioca 80 também apresentou bons níveis de produção de conídios para todos os microrganismos;
3) Grão de bico caracterizou-se por estimular os 2 agentes entomopatogênicos, enquanto que feijão Jalo só beneficiou o micopatógeno.
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