EFEITOS DO TIOGLICOLATO DE SÓDIO EM CULTIVOS SUCESSIVOS DE TOXOPLASMA GONDII (NICOLLE & MANCEAUX, 1908) EM CAMUNDONGOSRESUMO
O presente experimento descreve uma técnica muito simples para a reativação de cultivas escassos de Toxoplasma gondii. Uma larga quantidade de parasitas purificados foi obtida a partir de exsudatos de camundongos infectados, após uma exposição seqüencial de seus macrófagos ao tioglicolato de sódio. Parâmetros de concentração da droga e tempo de ação da mesma, baseados em experimentos já realizados, foram estabelecidos e testados, para a obtenção da melhor resposta em relação ao preparo da população e ao menor índice de mortalidade para se iniciar o experimento. A seleção dos lotes de camundongos Swiss, seguiu critérios de peso, idade e sanidade. Parasitas obtidos por este método conservaram sua atividade biológica.
PALAVRAS-CHAVE:
Tioglicolatos; Toxoplasma gondii, Apicomplexa.
ABSTRACT
The present paper describes a very simple technique for increasing poor Toxoplsma gondii cultivations. Highly purified parasites were obtained from the peritoneal exudates of mice infected after sequential exposition of their macrophages to thioglycolic acid sodium salt. The parameters of concentrations and time of action of the drug were based in experiments released, established and tested, to obtain the best results for expression of the group of animals to start the test. The selection of Swiss mice lots were proceeded in criteria of weight, age and healthiness. Parasites obtained by this method conserved their biological activity.
KEY WORDS:
Tioglycolates; Toxoplasma gondii, Apicomplexa.
Entre as citações que desenvolvem aspectos da relação parasita-hospedeiro, referentes a Toxoplasma gondii, no estágio de taquizoitos, destacam-se entre outras, as de NICHOLS & O'CONNOR (1981) que apresentam fatores do processo de penetração e permanência em células hospedeiras. Estudos em sistemas celulares são apresentados por LYCKE et al. (1968), JACOBS (1972), NORIEGA & HAUSER(l988), CHAMBERLAND & CURRENT (1991) e mais recentemente por KASPER & MINEO (1994).
Outros que relataram procedimentos em manutenção e cultivo in vitro como o de DUBEY & BEATTIE (1988) e de cultivo in vivo, utilizando células de sarcoma T. G. 180, as quais implementam uma maior multiplicação do parasita (COUZINEAU & BAUFINEDUCROCQ, 1970), nos levaram a buscar uma técnica mais simples de implementação e manutenção do cultivo in vivo e que conservasse suas características biológicas. Para tal partimos das observações de ADAMS (1979) sobre cultura de macrófagos e associamos a esses dados, o cultivo de T. gondii.
Foram utilizados os seguintes produtos químicos com alto grau de pureza: NaCl (Cloreto de Sódio)ª e C2 Hp2 SNa (Tioglicolato de Sódio)b.
As amostras de Toxoplasma gondii na forma de taquizoitos da cepa RH se desenvolveram na cavidade peritoneal de camundongos Swiss, machos e jovens. Os fluidos peritoneais foram extraídos após três dias da inoculação e coletados em solução salina estéril a 0,85% (PN).
Multiplicação da cepa de T. gondii em macrófagos peritoneais
A cavidade que normalmente contém cerca de 2-3 x 106 macrófagos residentes passa, sob a ação do tioglicolato, após um prazo de 3 a 5 dias, a apresentar um valor da ordem de 20-30 x 106 seg. ADAMS (1979).
O desenvolvimento de cultivos escassos e pouco reprodutíveis de T. gondii se processou a partir de uma inoculação inicial de 0,25 mL/camundongo, de uma solução de tioglicolato de sódio a 0,012 g/mL em salina esterilizada, em uma população com peso médio unitário de 25 gramas.
Os cálculos se basearam na LD5 0 i.p. do tioglicolato de sódio, que é de 148 mg/kg, correspondendo a 3,7 mg/camundongo. Um inóculo com 3,0 mg foi escolhido por apresentar a menor taxa de letalidade.
Transcorridas 72 horas, os camundongos receberam um inóculo intraperitoneal de 0,5 U com seringa de insulina/animal com uma suspensão de baixa contagem de taquizoitos: < 10 organismos/campo microscópico (400x). Esta etapa portanto caracterizou o uso de um inóculo com baixa reprodutibilidade.
Na terceira fase, decorrido um intervalo de 80 horas, foram recolhidos os exsudatos que ainda apresentavam baixa contagem e reunidos em um "pool" que assim foi repassado para um novo lote de camundongos normais, com perfil semelhante ao do primeiro lote em relação a idade e peso. O inóculo se manteve em 0,5 U/animal.
A coleta dos exsudatos da terceira etapa, após um intervalo de mais três dias, apresentou um enriquecimento da cepa em 72% da população, registrando contagens acima de 100 organismos/campo (400x). Além disso, a cepa recuperou novamente sua capacidade de reinfectar novos camundongos em nova seqüência e mantendo a mesma taxa de crescimento em cultivo, o que não ocorria anteriormente. Uma performance em torno destes resultados foi conseguida em pelo menos 50% dos eventos, com relacão à melhoria da resposta dos cultivos de T. gondii frente a macrofagos estimulados pelo tioglicolato de sódio.
Uma possível relação entre o aumento do número de macrófagos intraperitoneais de camundongos que recebem dose específica de tioglicolato de sódio e a reativação de uma cepa de T. gondii foi expressada quantitativa e qualitativamente através deste experimento. Este procedimento é uma alternativa simples e relativamente rápida de recuperação de cultivos de T. gondii face à fragilidade respectiva em relação a fatores como: presença satisfatória em número e resposta dos macrófagos, temperatura ambiental, sanidade dos animais, e inóculo que deve manter a virulência e um certo número de microrganismos por campo. Os fatores de influência e em menor escala a variação natural de peso entre os camundongos, podem ter refletido no grau obtido de performance.
Podemos destacar o fato do aumento de parasitas ter ocorrido apenas no segundo lote de camundongos em uso, o que evidenciou a necessidade dos mesmos entrarem em contato primeiro com macrófagos que receberam e/ou se multiplicaram a partir do tratamento com o tioglkolato, para em seguida se reativarem em um novo cultivo, de macrófagos que não receberam tratamento prévio com nenhum tipo de produto químico.
Em paralelo, uma certa correlação entre a proporção do aumento do número de macrófagos com o aumento do número de taquizoitos também foi revelada.
Estudos complementares poderão demonstrar quais os fatores intrínsecos dos macrófagos tratados e/ou gerados, que mudaram o tipo de comportamento desta cepa de T. gondii, como também colaborar na busca dos mecanismos de seleção dos taquizoitos agressivos, fenômeno ainda não elucidado (AMATO NETO et al., 1995).
A disponibilidade de utilização de materiais ricos e puros em parasitas é um pré-requisito para se obter procedimentos adequados em determinados tipos de produção de antígenos, com finalidades em provas diagnósticas e em pesquisa. Oprincipal objetivo foi uma colaboração neste sentido. O método preconizado reviabilizou cultivos de taquizoitos de T. gondii em sua forma de uso mais corrente, para tais finalidades·.
AGRADECIMENTOS
A Elaine Rodrigues Cides, pós-graduanda do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pelo auxilio na digitação do texto:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- ADAMS, D.O. Specific cell lines. Macrophages. Methods Enzymol., v.58, p.494-506, 1979.
- AMATO NETO, V.; SERVOLO DE MEDEIROS, E.A.; LEVI, G.C.; SEIXAS DUARTE, M. I. Toxoplasmose. 4.ed., São Paulo: Sarvier, 1995. p.13.
- CHAMBERLAND, S. & CURRENT, W. L. Use of mouse macrophage cell lines for in vitro propagation of Toxoplasma gondii RH tachyzoites. Proc. Soe. Exp. Biol. Med., v.197, n.2,p.150-157, 1991.
- COUZINEAU, P. & BAUFINE-DUCROCQ, H. Agglutination directe des toxoplasmas. Ann. Biol. Clin., v.28,p.411-415, 1970.
- DUBEY, J.P. & BEATTIE, C.P. Toxoplasmosis of Animais and Man. Florida: CRC Press Inc. 1988. p.30-32.
- JACOBS, L. New knowledge of toxoplasma and toxoplasmosis. Adv. Parasitol., v.11, p.631-669, 1972.
- KASPER, L.H. & MINEO, J.R. Attachment and invasion of host cells by Toxoplasma gondii. Parasitol. Today, v.10, n.5, p.184-188, 1994.
- LYCKE, E.; NORRBY, R.; REMINGTON, J. Penetration-enchancing facture extracted from Toxoplasma gondii wich increases its virulence formice. J. Bacteriol., v.96, n.3, p.785-788, 1968.
- NICHOLS, B.A. & O'CONNOR, G.R. Penetration of mouse peritoneal macrophages by the protozoan Toxoplasma gondii. Lab. Invest., v.44, n.4, p.324-335, 1981.
- NORIEGA, F.R. & HAUSER JR., W.E. Toxoplasma gondii maintenance in tissue culture: a new efficient method for culturing RH tachyzoites. J. Parasitol., v.74, n.3, p.495-9,1988.
