Cardiomiopatia PRKAG2: Um Estudo Caso-Controle sobre o Rendimento Diagnóstico da Histopatologia e da Análise Ultraestrutural da Biópsia Endomiocárdica

Resumo

Fundamento  As características histopatológicas da cardiomiopatia PRKAG2 foram relatadas de forma fragmentada.

Objetivo  Nosso objetivo foi avaliar sistematicamente as características patológicas cardíacas da cardiomiopatia PRKAG2 em uma grande coorte de pacientes e avaliar seu potencial diagnóstico em comparação com o sequenciamento genético.

Métodos  Realizamos um estudo observacional, transversal, caso-controle, incluindo 18 pacientes com cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2 e 11 receptores de transplante cardíaco como grupo controle. Todos os pacientes foram submetidos a biópsia endomiocárdica percutânea do ventrículo direito. As amostras de tecido foram analisadas por meio de coloração com hematoxilina-eosina (H&E), coloração com ácido periódico-Schiff para glicogênio, tricrômico de Masson para fibrose e avaliação ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão. A significância estatística foi definida em p < 0,05 para todas as análises.

Resultados  Os corações com cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2 apresentaram aumento significativo dos cardiomiócitos, mitocôndrias com aparência normal, extensa vacuolização da maioria das miofibras, fibrose intersticial mínima (apenas dois pacientes apresentaram fibrose leve) e ausência de infiltração de células inflamatórias. A microscopia eletrônica de transmissão revelou abundante glicogênio citosólico, principalmente na região perinuclear, com depósitos adicionais nas áreas intermiofibrilares e subsarcolemáticas. Esse acúmulo pronunciado de glicogênio, observado consistentemente em todos os pacientes com PRKAG2, estava ausente nos controles.

Conclusão  O exame histológico e ultraestrutural de amostras de biópsia endomiocárdica do ventrículo direito revela um conjunto distinto de características que sugerem fortemente a cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2.

Palavras-chave
Proteínas Quinases Ativadas por AMP; Cardiomegalia; Microscopia Eletrônica de Transmissão

Figura Central:
Cardiomiopatia PRKAG2: Um Estudo Caso-Controle sobre o Rendimento Diagnóstico da Histopatologia e da Análise Ultraestrutural da Biópsia Endomiocárdica

Abstract

Background  The histopathological features of PRKAG2 cardiomyopathy have been reported in a fragmentary manner.

Objective  We aimed to systematically evaluate the cardiac pathological features of PRKAG2 cardiomyopathy in a large patient cohort and assess their diagnostic potential compared to genetic sequencing.

Methods  We conducted an observational, cross-sectional, case-control study including 18 patients with PRKAG2 cardiomyopathy and 11 heart transplant recipients as controls. All patients underwent percutaneous right ventricular endomyocardial biopsy. Tissue samples were analyzed using H&E staining, Periodic Acid-Schiff staining for glycogen, Masson’s trichrome for fibrosis, and ultrastructural assessment by transmission electron microscopy. Statistical significance was set at p < 0.05 for all analyses.

Results  PRKAG2 cardiomyopathy hearts exhibited significant cardiomyocyte enlargement, normal-appearing mitochondria, extensive vacuolization of most myofibers, minimal interstitial fibrosis (only two patients had mild fibrosis), and no inflammatory cell infiltration. Transmission electron microscopy revealed abundant cytosolic glycogen, primarily in the perinuclear region, with additional deposits in intermyofibrillar and subsarcolemmal areas. This pronounced glycogen accumulation, consistently observed in all PRKAG2 patients, was absent in controls.

Conclusion  Histological and ultrastructural examination of right ventricular endomyocardial biopsy samples reveals a distinct set of features that strongly suggest PRKAG2 cardiomyopathy.

Keywords
AMP-Activated Protein Kinases; Cardiomegaly; Microscopy, Electron, Transmission

Central Illustration:
PRKAG2 Cardiomyopathy: A Case-Control Study on the Diagnostic Yield Of Histopathology and Ultrastructural Analysis from Endomyocardial Biopsy

Introdução

Mutações no gene PRKAG2, que codifica a subunidade regulatória γ2 da proteína quinase ativada por AMP, levam a um fenótipo altamente penetrante de hipertrofia ventricular, pré-excitação, taquiarritmias atriais, bradicardia sinusal progressiva e anormalidades da condução cardíaca.¹ A principal característica patológica – acúmulo anormal de glicogênio nos cardiomiócitos – levou inicialmente à sua classificação como uma cardiomiopatia de armazenamento de glicogênio e uma fenocópia da cardiomiopatia hipertrófica sarcomérica.²

Desde suas primeiras descrições, as características morfológicas da cardiomiopatia PRKAG2 têm sido relatadas principalmente utilizando amostras de biópsia endomiocárdica (BEM) do septo ventricular direito,²-¹⁵ um número limitado de autópsias de pacientes que morreram subitamente,²,¹⁴,¹⁶,¹⁷,¹⁸e corações explantados de receptores de transplante.⁷,¹⁹ Os achados patológicos parecem depender do momento da biópsia dentro da história natural da doença, com anormalidades mais pronunciadas observadas em pacientes com manifestações clínicas graves.¹-¹⁹Por exemplo, corações explantados de receptores de transplante com insuficiência cardíaca terminal frequentemente exibem características distintas em comparação com aqueles de pacientes jovens que sucumbiram à morte súbita cardíaca.

Desde a identificação do gene PRKAG2,²⁰,²¹ o sequenciamento genético se tornou o padrão ouro para o diagnóstico. No entanto, o papel potencial da avaliação da patologia cardíaca nunca foi examinado sistematicamente. A BEM do ventrículo direito (VD) é uma ferramenta diagnóstica segura que foi amplamente utilizada na avaliação de suspeitas de cardiomiopatias por armazenamento de glicogênio antes da ampla disponibilidade dos testes genéticos.²²,²³ No Brasil e em outros países de baixa renda, o acesso aos testes genéticos permanece limitado, enquanto a BEM é coberta pelo sistema público de saúde. Não está claro, porém, se a BEM oferece acurácia diagnóstica comparável à do sequenciamento genético, que apresenta um rendimento relatado de 100%.

Assim, realizamos um estudo transversal caso-controle para avaliar sistematicamente as características histológicas e ultraestruturais da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2, utilizando: (1) uma coorte de 18 pacientes de cinco famílias portadoras das variantes R302Q (a variante patogênica mais frequentemente relatada) e H401Q do gene PRKAG2; (2) um grupo controle de 11 corações transplantados estruturalmente normais. A análise histológica e ultraestrutural da BEM do VD revelou um conjunto de características sugestivas de cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2, incluindo aumento do tamanho dos cardiomiócitos, vacuolização pronunciada, ausência de fibrose intersticial, acúmulo substancial de glicogênio e densidade volumétrica mitocondrial preservada (Figura Central).

Métodos

Desenho do estudo

Este estudo observacional prospectivo de caso-controle foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais (SISNEP CAAE: 0511.0.203.418-11). O consentimento livre e esclarecido para a realização da BEM foi obtido de todos os participantes. O estudo foi delineado para avaliar o desempenho diagnóstico da BEM em pacientes com cardiomiopatia por PRKAG2 geneticamente confirmada, utilizando receptores de transplante como grupo controle.

População do estudo

O grupo de casos compreendeu 18 pacientes com variantes patogênicas do gene PRKAG2 (16 com a mutação R302Q e dois com a mutação H401Q, recentemente relatada pelo nosso grupo¹²). O grupo controle consistiu em 11 receptores de transplante cardíaco sem evidência clínica de rejeição do enxerto, submetidos a BEM de rotina em até 10 dias após o transplante para monitoramento de rejeição. Os corações transplantados apresentavam estrutura e eletrocardiografia normais, conforme avaliado por ecocardiografia e eletrocardiografia.

Análise genética

O DNA genômico de pacientes com cardiomiopatia PRKAG2, isolado de leucócitos do sangue total, foi sequenciado utilizando um painel de 52 genes para cardiomiopatia. Uma biblioteca genômica foi preparada com um painel personalizado AmpliSeq e sequenciada utilizando um sistema PGM Ion Torrent. As sequências foram alinhadas ao genoma de referência hg19 e as variantes de nucleotídeos foram filtradas seguindo as diretrizes do American College of Medical Genetics and Genomics e da Association for Molecular Pathology.²⁴,²⁵ Os membros da família foram submetidos a triagem específica para mutações por sequenciamento de Sanger utilizando um analisador genético ABI 3500XL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

Biópsia endomiocárdica

Sob anestesia local, um operador experiente realizou BEM utilizando uma pinça de biópsia miocárdica Cook^® (Bloomington, IN, EUA), visando o septo interventricular direito para obter cinco amostras de tecido. Três fragmentos foram fixados em formalina a 10% por 12 horas à temperatura ambiente para microscopia óptica. Os dois restantes foram fixados em solução de Karnovsky (2,5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,4) durante a noite a 4 °C para microscopia eletrônica. Nenhum paciente apresentou complicações.

Microscopia ótica

Fragmentos de BEM fixados em formalina foram incluídos em parafina, seccionados (2 µm) e corados com hematoxilina-eosina (H&E), ácido periódico-Schiff (PAS) e tricrômico de Masson. O diâmetro dos cardiomiócitos (≥12 miócitos por paciente) foi medido utilizando o software ImageJ v1.49 (National Institutes of Health, EUA). As fotomicrografias foram obtidas com aumento de 400× utilizando um microscópio Axio Imager Z2 - Apotome 2 (Zeiss, EUA).

Microscopia eletrônica de transmissão

As amostras foram pós-fixadas em OsO₄ a 1%, coradas durante a noite com acetato de uranila a 2%, desidratadas em etanol e incluídas em Epon 812 (EMS, EUA). Cortes ultrafinos (50 nm) foram obtidos utilizando um ultramicrótomo com lâmina de diamante, montados em grades de cobre e corados com citrato de chumbo de Reynolds. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada a 80 kV utilizando um microscópio FEI Tecnai G2-12 Spirit, equipado com uma câmera CCD SIS-MegaView 3. As micrografias foram obtidas com ampliação de 9.900×. Imagens foram selecionadas aleatoriamente de regiões centrais de cardiomiócitos e analisadas utilizando o software ImageJ. As densidades volumétricas (Vv) de glicogênio, mitocôndrias e miofibrilas foram determinadas usando o método clássico de contagem de pontos com uma grade de 165 pontos (500 × 500 nm) projetada em cada imagem, seguindo Cantuária et al.²⁶ Pelo menos 10 cardiomiócitos por paciente foram submetidos à análise morfométrica.

Análise estatística

Como a cardiomiopatia PRKAG2 é uma doença extremamente rara, a amostra do estudo foi definida por conveniência, incluindo todos os pacientes elegíveis disponíveis durante o período do estudo. As imagens de microscopia foram analisadas de forma cega por dois investigadores. Quaisquer discrepâncias foram resolvidas por consenso com um terceiro investigador. Os dados foram analisados utilizando o GraphPad Prism v6.1 (GraphPad Software, EUA) e apresentados como média ± desvio padrão (DP). As variáveis categóricas foram apresentadas como frequências absolutas e relativas. Os dados morfométricos apresentaram distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk). A correlação de Pearson avaliou a relação entre o diâmetro dos cardiomiócitos e o Vv da análise por MET. As comparações entre os grupos foram realizadas utilizando o teste exato de Fisher bicaudal e o teste t de Student não pareado. A significância estatística foi definida como p < 0,05.

Resultados

Pacientes

O estudo incluiu 18 pacientes com cardiomiopatia PRKAG2 de cinco famílias não relacionadas (Tabela 1): 10 homens (55,5%), com idade média de 38,5 ± 11,8 anos. A pré-excitação ventricular foi altamente prevalente (15/18; 83,3%), consistentemente associada a uma via fasciculoventricular, e nenhuma via acessória atrioventricular foi identificada. Arritmias atriais ocorreram em 11 pacientes (61,1%), sendo taquicardia atrial em seis (33,3%), flutter atrial em três (16,7%) e fibrilação atrial em dois (11,1%). O grupo controle foi composto por 11 receptores de transplante cardíaco, 8 homens (72,7%), com idade média de 54,9 ± 9,6 anos (idade média dos doadores: 27 ± 8,7 anos, significativamente menor que o grupo PRKAG2, p = 0,043). Quatro doadores apresentavam hipertensão sistêmica, estavam em tratamento anti-hipertensivo e demonstraram hipertrofia leve na ecocardiografia. Em conjunto, esses achados destacam a pré-excitação ventricular e as arritmias atriais como características clínicas definidoras da cardiomiopatia PRKAG2.

Tabela 1
– Características clínicas dos pacientes e perfil histopatológico da biópsia endomiocárdica

Casos	Diagnóstico	Variante	Idade do doador	Idade dos casos	Sexo	Onda delta	Feixe fascículo-ventricular	Taquicardia atrial	Flutter atrial	Fibrilação atrial	Ecocardiograma Hipertrofia do VE	Vacúolos (HE/Manson)	Vacúolos qualitativos	Fibrose intersticial	Desarranjo de miócitos	Inflamação	Diâmetro do miócito (µm2)	Vv Miofibrilas (%)	Vv Mitocôndrias (%)	Vv Glicogênio (%)
1	PRKAG2	R302Q		47	F	sim/MP	sim*				não	sim	pronunciado	não	não	não	19,20	48,18	27,58	14,85
2	PRKAG2	R302Q		32	F	sim	sim				não	sim	pronunciado	não	não	não	20,16	29,09	33,03	31,82
3	PRKAG2	R302Q		48	F	não	não				não	sim	pronunciado	não	não	não	18,85	x	x	x
4	PRKAG2	R302Q		38	F	sim	sim	paroxístico			não	sim	pronunciado	não	não	não	20,18	39,40	38,18	13,64
5	PRKAG2	R302Q		50	M	sim/MP	sim*			paroxístico	não	sim	pronunciado	não	não	não	17,20	45,10	29,21	16,89
6	PRKAG2	R302Q		39	F	não	não				não	sim	pronunciado	não	não	não	19,32	41,52	27,88	21,21
7	PRKAG2	R302Q		57	M	sim/MP	sim*				sim	sim	pronunciado	não	não	não	25,84	33,64	28,49	31,21
8	PRKAG2	R302Q		55	M	sim/MP	sim*		sim (RF)	persistente	sim	sim	pronunciado	slim leve	não	não	28,38	29,70	25,15	40,31
9	PRKAG2	R302Q		52	M	sim/MP	sim*				sim	sim	pronunciado	não	não	não	17,71	42,42	29,70	24,85
10	PRKAG2	R302Q		32	M	sim	sim				sim	sim	pronunciado	não	não	não	25,08	32,43	30,00	33,34
11	PRKAG2	R302Q		34	M	sim/MP	sim		sim (RF)		sim	sim	pronunciado	não	não	não	26,09	24,85	22,12	38,49
12	PRKAG2	R302Q		36	M	sim/MP	sim*	paroxístico			sim	sim	pronunciado	não	não	não	21,33	39,09	29,40	20,30
13	PRKAG2	R302Q		46	F	sim	sim	paroxístico	sim (RF)		sim	sim	pronunciado	não	não	não	18,24	29,70	24,85	34,85
14	PRKAG2	R302Q		39	M	sim	sim	paroxístico			sim	sim	pronunciado	slim leve	não	não	x	51,22	31,52	10,00
15	PRKAG2	R302Q		30	M	sim/MP	sim			persistente	sim	sim	pronunciado	não	não	não	23,00	32,43	21,52	39,09
16	PRKAG2	H401Q		19	F	sim	sim			paroxístico	sim	sim	pronunciado	não	não	não	21,68	45,76	30,91	15,46
17	PRKAG2	H401Q		18	F	sim	sim				sim	sim	pronunciado	não	não	não	21,35	42,12	36,37	10,31
18	PRKAG2	R302Q		22	M	sim	sim				sim	sim	pronunciado	não	não	não	21,97	34,25	20,61	33,03
19	transplante		24	64	M	não	não				não	não		não	não	slim leve	13,95	54,58	28,05	13,11
20	transplante		31	53	M	não	não				não	sim	leve	não	não	não	16,28	55,46	25,76	9,70
21	transplante		29	55	M	não	não				não	não		slim leve	não	não	13,03	55,28	32,83	2,78
22	transplante		18	52	M	não	não				não	não		não	não	não	16,51	59,88	28,65	5,95
23	transplante		26	61	F	não	não				não	não		não	não	não	16,42	61,79	29,45	4,24
24	transplante		24	56	M	não	não				não	não		não	não	não	17,49	58,79	31,05	3,99
25	transplante		33	33	F	não	não				não	sim	leve	slim leve	não	não	12,77	x	x	x
26	transplante		30	62	M	não	não				sim	não		não	não	não	18,24	x	x	x
27	transplante		15	45	M	não	não				sim	não		slim leve	não	slim leve	21,15	x	x	x
28	transplante		20	68	F	não	não				sim	não		não	não	não	18,18	58,71	30,73	3,97
29	transplante		47	55	M	não	não				sim	não		não	não	não	21,21	49,70	40,30	2,73

• *: indica que a pré-excitação desapareceu após o bloqueio atrioventricular; F: feminino; M: masculino; ECG: eletrocardiograma; VE: ventrículo esquerdo; HE: Hematoxilina eosina; MP: marcapasso; RF: ablação por radiofrequência.

Avaliação da biópsia endomiocárdica

Análise histológica

Pacientes com cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2 apresentaram aumento acentuado dos cardiomiócitos, vacuolização pronunciada e ausência de fibrose intersticial, exceto em dois casos (pacientes 8 e 14) com fibrose leve (Tabelas 1 e 2). Não foi observada infiltração de células inflamatórias (Figura 1). Em contraste, as amostras de controle mostraram infiltrado inflamatório leve em 2 de 11 casos (18,1%), arquitetura normal dos cardiomiócitos, fibrose intersticial leve em 3 casos (27,2%) e vacúolos citosólicos em uma minoria de miócitos em 2 casos (18,1%) (Figura 2). Receptores de transplante cujos doadores apresentavam hipertensão sistêmica exibiram cardiomiócitos maiores do que aqueles cujos doadores eram normotensos (15,2 ± 1,9 µm vs. 19,7 ± 1,7 µm; p = 0,0037).

Tabela 2
– Achados histopatológicos do tecido cardíaco

	Transplante de coração (n= 11)	Cardiomiopatia PRKAG2 (n= 17)	Valor p
Fibrose	2/11 (18%)	2/17 (12%)	0,3697a
Inflamação	2/11 (18%)	0/17 (0%)	0,1967a
Vacuolização	2/11 (18%)	17/17 (100%)	<0,0001a
Glicogênio (MET)	0/8 (0%)	17/17 (100%)	<0,0001a
Diâmetro dos cardiomiócitos (µm)#	16,84 ± 2,86	21,50 ± 3,23	0,0018b

• ^#Dados apresentados como médias de 12 a 100 cardiomiócitos/paciente; a: Teste exato de Fisher; b: Teste t de Student para amostras independentes; MET: Microscopia eletrônica de transmissão.

Figura 1
– Achados histopatológicos em um paciente com cardiomiopatia PRKAG2. Cortes histológicos corados com tricrômico de Masson (A, C) revelam arquitetura miocárdica normal, densidade mitocondrial normal, ausência de fibrose ou inflamação e vacuolização pronunciada dos miócitos. Em pontos selecionados, a vacuolização não foi observada (inserção B), em contraste com a maioria das áreas com intensa vacuolização dos cardiomiócitos (inserção C). Micrografias eletrônicas de transmissão (painéis D, G) exibiram grandes quantidades de glicogênio perinuclear (D) e/ou intermiofibrilar (E, F). Os painéis F e G mostram partículas β de glicogênio como pontos pretos com 30 nm; *: vacuolização; Gly: glicogênio; Lp: lipofuscina; Mf: miofibrila; Mit: mitocôndria.

Figura 2
– Achados histopatológicos de biópsia endomiocárdica de um paciente transplantado cardíaco. Cortes corados com A coloração tricrômica de Masson (A, D) revelou arquitetura miocárdica normal, sem fibrose, vacuolização ou inflamação, e densidade mitocondrial normal. Alguns pacientes apresentaram infiltrados inflamatórios (setas) (B) e algumas pequenas áreas com vacuolização (C, D). Apesar da presença desta última, as micrografias eletrônicas de transmissão não revelaram depósitos de glicogênio (E, F). *: vacuolização; Gly: glicogênio; Mf: miofibrila; Mit: mitocôndria.

Microscopia eletrônica de transmissão

Os cardiomiócitos PRKAG2 apresentaram extenso acúmulo de glicogênio, predominantemente na região perinuclear, com depósitos adicionais nas áreas intermiofibrilares e subsarcolemáticas. Mitocôndrias e sarcômeros pareceram preservados na maioria dos miócitos (Figura 1D-G). Alguns cardiomiócitos continham partículas de β-glicogênio dispersas entre as mitocôndrias. Grânulos de lipofuscina, correspondentes a resíduos lisossômicos, foram observados tanto nas amostras PRKAG2 quanto nas amostras controle. Pacientes com a mutação H401Q exibiram achados histológicos e ultraestruturais idênticos aos da variante R302Q. Notavelmente, nenhuma das amostras controle apresentou acúmulo de glicogênio, mesmo nos casos com leve vacuolização (Figura 2).

A análise quantitativa por MET revelou um aumento de 6 vezes na densidade de glicogênio (p < 0,0001) em pacientes com PRKAG2, uma diminuição de aproximadamente 35% na densidade miofibrilar (p < 0,0001) e nenhuma diferença na densidade mitocondrial entre os grupos (Figura 3). Os valores individuais de densidade volumétrica (Vv) mostraram um limiar claro separando PRKAG2 dos controles. Os casos de PRKAG2 apresentaram pelo menos uma imagem de MET com Vv miofibrilas < 30% e Vv glicogênio > 22%. Os casos controle não atingiram esses limiares. Observou-se uma correlação positiva entre o diâmetro do cardiomiócito e o acúmulo de glicogênio, enquanto o conteúdo miofibrilar apresentou uma correlação negativa. A densidade volumétrica mitocondrial não apresentou correlação com o diâmetro do cardiomiócito (Tabela 3).

Figura 3
– Densidades volumétricas (Gráfico de densidade óptica (Vv) de miofibrilas (A, B), mitocôndrias (C, D) e glicogênio (E, F) de pacientes com PRKAG2 (barras/círculos brancos) e controles (barras/pontos pretos). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (A, C, E) (número de pacientes descrito acima da barra, teste t de Student não pareado) ou valores individuais de cada paciente (B, D, F) (10 campos por paciente); a linha vermelha indica um limiar nos parâmetros entre os pacientes com PRKAG2 e os controles.

Tabela 3
– Correlação de Pearson entre o diâmetro dos cardiomiócitos e as densidades volumétricas obtidas por MET

	Diâmetro dos cardiomiócitos (µm)		Vv Miofibrilas (%)		Vv Mitocôndrias (%)		Vv Glicogênio (%)
	Person r	Valor-p	Person r	Valor-p	Person r	Valor-p	Person r	Valor-p
Diâmetro dos cardiomiócitos (µm)			-0,757	< 0,0001	-0,217	0,309	0,706	< 0,001
Vv Miofibrilas (%)					0,338	0,099	-0,924	< 0,0001
Vv Mitocôndrias (%)							-0,616	< 0,001
Vv Glicogênio (%)

Dados ausentes

Problemas técnicos durante o processamento por MET impediram uma avaliação confiável em 1 dos 18 pacientes com PRKAG2. A análise por microscopia óptica não foi possível para um paciente com PRKAG2. Cada paciente teve dois conjuntos de amostras: um para microscopia óptica e outro para MET. No total, 5 dos 58 conjuntos de dados (8,6%) estavam incompletos (Tabela 1).

Discussão

As características patológicas da cardiomiopatiaPRKAG2 foi descrita em um número limitado de casos, principalmente por meio de BEM, autópsia de vítimas de morte súbita ou exame de corações explantados de receptores de transplante. Esses relatos sugerem que os achados histopatológicos podem variar dependendo do contexto clínico, com alterações mais pronunciadas observadas em corações explantados e em casos de morte súbita.

Dados anatomopatológicos da literatura (Tabela Suplementar 1) indicam que achados morfológicos foram descritos em apenas 22 de 314 pacientes (7%) com cardiomiopatia PRKAG2. Ao considerar apenas os casos submetidos a BEM percutânea do VD para fins diagnósticos, esse número é ainda menor, totalizando 14 pacientes (4,5%). O presente estudo é a primeira análise sistemática da BEM do VD em uma grande coorte de pacientes com cardiomiopatia PRKAG2, avaliando sua utilidade diagnóstica e a especificidade dos achados em comparação a um grupo controle de receptores de transplante cardíaco cujos doadores não apresentavam a doença.

Os principais resultados do estudo demonstraram que a BEM apresentou alta acurácia diagnóstica em nossa coorte: todos os pacientes com PRKAG2 positivo (18/18, 100%) exibiram as características morfológicas típicas, incluindo cardiomiócitos aumentados sem desarranjo arquitetônico, vacuolização acentuada e um aumento de 6 vezes na densidade de glicogênio (p < 0,0001). Em contraste, nenhum dos controles apresentou acúmulo de glicogênio e apenas 2/11 exibiram vacuolização focal. Esses resultados indicam que a BEM diferenciou de forma confiável a cardiomiopatia associada ao PRKAG2 dos controles nesta população estudada.

A vacuolização pronunciada dos cardiomiócitos é uma característica bem documentada da cardiomiopatia PRKAG2,⁹-¹⁴,¹⁸ conforme observado em estudos anteriores utilizando coloração H&E ou tricrômico de Masson, tipicamente associada a grânulos PAS-positivos e grandes quantidades de partículas de glicogênio citosólico em MET. Embora a vacuolização também tenha sido observada em dois casos controle, ela foi focal e limitada a uma minoria de cardiomiócitos, provavelmente devido a artefatos de fixação ou processamento (Figura 2). Em contraste, os pacientes com PRKAG2 exibiram vacuolização generalizada na maioria dos cardiomiócitos.

A explicação predominante para a presença de vacúolos os considera como imagens negativas, um achado indireto resultante da lavagem do glicogênio durante a preparação da lâmina. No entanto, essa suposição não explica completamente a presença de vacúolos em alguns membros do grupo controle. Em um caso controle (caso 20), a MET mostrou claramente a ausência de acúmulo de glicogênio no citosol (Tabela 1). Vale ressaltar que alguns indivíduos normais podem apresentar maior densidade volumétrica de glicogênio (Figura 3F), porém, não demonstram o acúmulo de glicogênio observado em pacientes com PRKAG2 (Figura 1D-G vs. Figura 2EF).

A hipertrofia cardíaca é uma característica marcante da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2. Recentemente, relatamos a utilidade diagnóstica da ecocardiografia transtorácica, que identificou hipertrofia ventricular esquerda em 25/30 (86%) e hipertrofia ventricular direita em 26/30 (90%) portadores de variantes patogênicas do PRKAG2.²⁷ No entanto, em nível celular, a hipertrofia é tipicamente caracterizada por um aumento no número de unidades sarcoméricas dentro dos cardiomiócitos. O aumento do diâmetro dos cardiomiócitos, por si só, não é diagnóstico de hipertrofia, visto que a expansão celular pode resultar de diversos fatores, incluindo o armazenamento excessivo de substâncias intracelulares como glicogênio, lipídios e água, que podem se manifestar como hipertrofia ventricular em exames de imagem cardíaca.

Estudos recentes utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC-CMs)²⁸,²⁹ mostraram que mutações no gene PRKAG2 (R302Q e N488I) induzem o aumento do tamanho celular devido ao acúmulo de glicogênio, impulsionado por um aumento persistente e inadequado na atividade da AMPK. Notavelmente, a inibição da atividade da AMPK com o composto C reduziu o armazenamento de glicogênio e reverteu a hipertrofia detectada por imagem.²⁹ A subunidade β da AMPK contém um domínio regulatório de ligação ao glicogênio, permitindo que a AMPK do tipo selvagem funcione como um sensor de glicogênio,³⁰ enquanto a microscopia de imunogold mostrou que as subunidades da AMPK se co-localizam com partículas de glicogênio, com a subunidade β1 posicionada na periferia das rosetas de glicogênio.³¹

Em nosso estudo, observamos uma correlação positiva entre o aumento do tamanho dos cardiomiócitos e o acúmulo intracelular de glicogênio, juntamente com uma correlação inversa entre a densidade volumétrica das miofibrilas e o diâmetro dos cardiomiócitos. Como a densidade volumétrica é uma medida relativa, não podemos descartar um possível aumento no conteúdo de miofibrilas no contexto de cardiomiócitos maiores. Curiosamente, um estudo utilizando um modelo de camundongo transgênico com superexpressão cardíaca do mutante N488I PRKAG2, combinado com uma mutação de inserção no gene do glicogênio sintase muscular (GYS1) – que inibe a atividade do glicogênio sintase estimulada pela glicose-6-fosfatase – conseguiu resgatar o fenótipo de armazenamento de glicogênio e a pré-excitação ventricular. No entanto, isso não afetou a hipertrofia cardíaca ou o aumento do tamanho dos cardiomiócitos, sugerindo que mecanismos além do acúmulo de glicogênio contribuem para a hipertrofia na cardiomiopatia PRKAG2.³²

Uma descoberta importante do nosso estudo foi que mesmo pacientes com PRKAG2 sem hipertrofia cardíaca aparente apresentaram alterações morfológicas, incluindo aumento do conteúdo de glicogênio, ausência de inflamação e fibrose mínima ou ausente (Tabela 1). Embora a vacuolização dos cardiomiócitos ocorra em corações normais e em outras doenças, ela é muito mais pronunciada e disseminada na cardiomiopatia associada à PRKAG2 (Figura 1). Além disso, os grandes depósitos de glicogênio identificados na MET foram altamente específicos para PRKAG2 e ausentes nos controles. Exceções incluem casos com fibrose intersticial e desarranjo arquitetônico, relatados em variantes raras do PRKAG2, como K485E e E506K.³,⁶ Os achados em corações explantados ou autopsiados em doença avançada também diferem, mostrando mais fibrose,⁷,⁸,¹⁴,¹⁶-¹⁹desarranjo arquitetônico¹⁶,¹⁷e degeneração ocasional de miócitos.¹⁴,¹⁷ Essas características de “estágio final” também foram relatadas em variantes comuns do PRKAG2, como R302Q e N488I.¹⁶,¹⁷

Neste estudo, a correlação genótipo-fenótipo foi consistente em nossa coorte. Todos os membros da família de um probando com uma variante no gene PRKAG2 e características clínicas típicas também eram portadores da mesma variante, em consonância com relatos anteriores que descrevem a forte associação entre mutações no PRKAG2 e esse fenótipo. Essa concordância completa em nossa série reforça a robustez da associação genético-clínica, evitando generalizações excessivas para além da população estudada.

Outras condições precisam ser diferenciadas da cardiomiopatia PRKAG2. A cardiotoxicidade induzida pela hidroxicloroquina, tipicamente resultante do uso prolongado para doenças do tecido conjuntivo, também se apresenta com vacuolização pronunciada dos miócitos, que se estende ao músculo esquelético. A BEM nesse contexto mostra fibrose intersticial focal sem inflamação. A microscopia eletrônica revela extensas inclusões lisossômicas, corpos mieloides e inclusões curvilíneas, mas sem acúmulo de glicogênio.³³ A doença de Danon (mutação LAMP2), que exibe um fenótipo cardíaco grave predominante em homens jovens (geralmente abaixo de 20 anos),³⁴ met um perfil microscópico distinto. O exame post-mortem de dois corações mostrou hipertrofia maciça, desarranjo substancial dos miócitos e fibrose, com aglomerados proeminentes de miócitos vacuolizados e inclusões de material granular amorfo em algumas células dentro das regiões cicatriciais. A doença de Anderson-Fabry, que pode apresentar um fenótipo cardíaco dominante, está associada ao envolvimento multissistêmico.³⁵ Histologicamente, apresenta extensa vacuolização dos cardiomiócitos, fibrose e desarranjo dos miócitos, particularmente no VD, com necrose ocasional de miócitos e substituição por macrófagos espumosos. No entanto, não se observa acúmulo de glicogênio. Além disso, as cardiomiopatias mitocondriais, como as associadas à mutação 3243A>G, podem apresentar um fenótipo semelhante ao da cardiomiopatia hipertrófica (CMH), frequentemente diagnosticadas erroneamente como cardiomiopatia isolada. Esses pacientes podem não apresentar episódios semelhantes a acidente vascular cerebral (síndrome MELAS), e a MET tipicamente revela proliferação mitocondrial.³⁶

Limitações

O grupo de controle consistiu em pacientes transplantados cardíacos cujos corações doadores eram significativamente mais jovens do que aqueles com cardiomiopatia PRKAG2. No entanto, não se espera que as alterações patológicas características da cardiomiopatia PRKAG2 surjam do envelhecimento normal. Alguns dados foram perdidos devido a problemas durante a fixação ou o processamento das amostras (para MET: três casos no grupo controle e um no grupo com cardiomiopatia PRKAG2; para microscopia óptica: um caso no grupo com cardiomiopatia PRKAG2). Considerando que havia apenas 2/36 conjuntos de dados faltantes (5,5%) no grupo com cardiomiopatia PRKAG2, é improvável que isso tenha tido um impacto significativo em nossos resultados.

Conclusão

Os achados da BEM percutânea do VD revelam alterações morfológicas características, diagnósticas da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2, em todos os genótipos dos pacientes positivos. A MET desempenha um papel importante na detecção do acúmulo substancial de glicogênio nos cardiomiócitos. As anormalidades histopatológicas e ultraestruturais descritas neste estudo não foram observadas nas amostras de controle. Nossos achados sugerem que a BEM, associada à microscopia óptica e eletrônica, pode auxiliar no diagnóstico da cardiomiopatia associada ao gene PRKAG2. Estudos adicionais são necessários para validar a microscopia como ferramenta diagnóstica para essa condição.

Material suplementar

Supplementary Table 1

Supplementary Table 1

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Centro de Microscopia da Universidade Federal de Minas Gerais (http://www.microscopia.ufmg.br) pelo fornecimento de equipamentos e suporte técnico para experimentos envolvendo microscopia eletrônica, e Kinulpe Honorato Sampaio é beneficiário do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (303206/2022-5).

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• Vinculação acadêmica:
  Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Carla de Oliveira pela Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais.
• Aprovação ética e consentimento informado:
  Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Minas Gerais sob o número de protocolo SISNEP CAAE: 0511.0.203.418-11. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.
• Uso de Inteligência Artificial:
  Os autores não utilizaram ferramentas de inteligência artificial no desenvolvimento deste trabalho.
• Disponibilidade de Dados:
  Os conteúdos subjacentes ao texto da pesquisa estão contidos no manuscrito.
• Fontes de financiamento:
  O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
• *Material suplementar
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Editado por

• Editor responsável pela revisão:
  Natália Olivetti

Disponibilidade de dados

Os conteúdos subjacentes ao texto da pesquisa estão contidos no manuscrito.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Mar 2026
• Data do Fascículo
  Fev 2026

Histórico

• Recebido
  10 Mar 2025
• Revisado
  25 Set 2025
• Aceito
  13 Jan 2026