Estratégias analíticas com cromatografia e espectrometria de massas para biomonitorização da exposição ao benzeno pela determinação do ácido <i>S</i>-fenilmercaptúrico urinário

Gonçalves, Eline Simões; Borges, Renato Marçullo; Carvalho, Leandro Vargas Barreto de; Alves, Sérgio Rabello; André, Leiliane Coelho; Moreira, Josino Costa

doi:10.1590/2317-6369000127615

Revisão, Dossiê: Benzeno em Postos de Combustíveis • Rev. bras. saúde ocup. 42 (suppl 1) • 2017 • https://doi.org/10.1590/2317-6369000127615 linkcopiar

Estratégias analíticas com cromatografia e espectrometria de massas para biomonitorização da exposição ao benzeno pela determinação do ácido S-fenilmercaptúrico urinário

Analytical strategies with chromatography and mass spectrometry for biomonitoring of benzene exposure by determination of urinary S-phenylmercaturic acid

Autoria SCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

Introdução: o benzeno é uma substância de reconhecida toxicidade e sua biomonitorização torna-se fundamental para a prevenção de danos à saúde humana, principalmente em situações de exposição ocupacional. Dentre os biomarcadores de exposição, o ácido S-fenilmercaptúrico é considerado o único específico, mas, devido a suas baixas concentrações na urina, é requerido o uso de técnicas analíticas sensíveis capazes de quantificar traços.

Objetivo: revisar metodologias baseadas na cromatografia e na espectrometria de massas para a determinação do ácido S-fenilmercaptúrico.

Método: revisão da literatura sobre a determinação do ácido S-fenilmercaptúrico urinário por técnicas de cromatografia e espectrometria de massas, nas principais bases de dados científicas, considerando o período entre 1951 e 2015.

Resultados: 120 documentos serviram como base teórica para a construção desta revisão. A técnica analítica mais empregada foi o acoplamento da cromatografia a líquido com a espectrometria de massas. Contudo, os métodos diferem quanto ao preparo das amostras.

Conclusão: o alto custo de aquisição e a manutenção de equipamentos são fatores limitantes para a difusão dos sistemas de cromatografia e espectrometria de massas. No entanto, sua elevada sensibilidade e seletividade faz com que essas técnicas, acopladas, possibilitem elucidar situações de exposição ocupacional e ambiental a poluentes, como o benzeno.

Palavras-chave:
benzeno; ácido S-fenilmercaptúrico urinário; ácido trans, trans-mucônico; cromatografia e espectrometria de massas

Estudo	Pré-tratamento	Extração/Clean up	Técnica de análise	Figuras de mérito da validação de método
Melikian et al.⁽¹³⁾	Estocagem: -20 ºC;	Extração por Fase Sólida (SPE)	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): 75-85;
	Amostra dopada com padrão deuterado (AFM ¹³C₆).	Cartucho SAX (1000 mg);	Ionização modo negativo;	LOD: 0,02 ng/injeção;
		Eluição dos analitos do cartucho com solução de ácido acético 10%.	Coluna: Ultramex C18 (250 x 2,0 mm i.d., 5 µm, Phenomenex ^®);	LOQ: 0,4 µg L^-1 (0,08 ng/injeção);
		Extração Líquido-Líquido	Fases Móveis: Solução Aquosa de ác. Acético 0,5% e MeOH;	Linearidade da Curva de Calibração: 0,033-333 ng/injeção;
		Com 3 x 5 mL de acetato de etila;	Fluxo: 160 µL min^-1;	R²: > 0,99;
		Extrato levado à secura com N_2(g);	MRM: AFM: 238 → 109; AFM ¹³C₆: 244 →115.	Coeficiente de variação: <10%;
		Resíduo ressuspendido com 150 µL de MeOH: sol. aquosa de ácido acético 1% (20/80, v/v).
Buratti et al.⁽⁵³⁾	Estocagem: -20 ºC;	Extração Líquido-Líquido	LC-Fluorescência	Rec (%): > 90;
		2,0 mL de urina + 100 µL de HCl 12 N + 2 mL de uma solução de clorofórmio e acetona (2:1, v/v);	Detecção: λ excitação = 375 nm, e λ emissão = 480 nm;	LOD: 1 µg L^-1;
		Agitação manual e centrifugação;	Coluna: Supelcosil DP (100 x 4,6mm i.d.; 3 µm, Supelco);	LOQ: não informado;
		Adição de sulfato de magnésio anídrico à fase orgânica;	Volume injetado: 50 µL;	Faixa Linear da Curva de Calibração: 10-250 µg L^-1;
		Extrato levado à secura com fluxo de N_2(g) a 50 ºC e redissolvido com 500 µL de NaOH 2 M contendo 2 mM de EDTANa₂;	Fases Móveis: Água:Tetrahidrofurano:Ácido	Coeficiente de variação intra-dia e inter-dia: <7% e <13%, respectivamente.
		Hidrólise a 95 ºC por 25 min. e então resfriamento em banho de gelo.	Trifluoracético (85:15:0,1, v/v); ACN:Ácido Trifluoracético (60:40:0,1, v/v);
		Derivatização	Fluxo: 2 a 4 mL/min.
		Com ácido fosfórico 5M, bicarbonato de amônia a 0,5 M (pH entre 7,5-8,5) e reagente Thiolite^®.
		Extração por Fase Sólida (SPE)
		Após a derivatização, a mistura é percolada no cartucho Oasis HLB- (1cc, Waters^®);
		Eluição com 200 µL de ACN;
		Extrato levado à secura;
		Resíduo redissolvido com 250 µL de ACN:H₂O (20:80, v/v).
Waidyanata et al.⁽⁴⁸⁾	Estocagem: -80 ºC (por até 8 anos);	Extração Líquido-Líquido	GC-MS	Rec (%): não informado;
	Acidificação com HCl;	Extração com de acetato de etila;	Temperatura do Injetor, da linha de transferência e da Fonte de Íons: 270, 280 e 186 ºC, respectivamente;	LOD: 2 µg L^-1;
	Dopagem com padrões deuterados.	Fase orgânica levada à secura com N_2(g).	Energia de Colisão (EI): 70 eV;	Faixa Linear da Curva de Calibração: 0-5 mg L^-1;
		Aquecimento a 100 ºC por 1h	Coluna: DB-5 (60 m, 0,25 mm i.d.e 0,25 µm de espessura de filme);	R²: > 0,98;
		Nova extração com acetato de etila;	Fluxo de He: 1,5 mL/min;	Coeficiente de variação: 10,5%.
		Adição de Na₂SO₄ anidro;	Modo de Injeção: Splitless;
		Extrato levado à secura com N_2(g).	Temperatura do Forno: 75 ºC/ min + rampa 10º/min até 230 ºC + 5 min por 230 ºC;
		Derivatização	Íons monitorados: AFM: 252; 257.
		Adição de 100 µL de hexano e 100 µL de reagente Tri-sil (Pierce) a 70 ºC por 30 mim.
Li et al.⁽⁷³⁾	Estocagem: -20 ºC;	Extração por Fase Sólida (SPE)	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): 87,8;
	Amostra homogeneizada e dopada com padrão deuterado (AFM d₅).	Cartucho: Oasis MAX (30 mg, Waters^®);	Ionização modo negativo;	Linearidade da Curva de Calibração: 0,4-200 µg L^-1.
		Extrato pronto para injeção.	Coluna: Genesis^TM C18 (50 x 2 mm i.d., 4 µm);	R²: > 0,998;
			Fases Móveis: Solução aquosa de ácido acético 0,01%; B: ACN + Ácido Acético 0,01%;	Coeficiente de variação intra-dia e inter-dia: <5,6% e <6,5%, respectivamente.
			MRM: AFM: 238 → 109; AFM-d5: 243 →114.	Exatidão: 1,7 a 2,0%;
				Desvio padrão relativo: <8,5%.
Manini et al.⁽⁴⁴⁾	Estocagem: -20 ºC;	Não foi realizada. Realizou-se injeção direta.	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): não informado;
	Centrifugação a 3000 X g por 10 min;		Ionização em modo negativo;	LOD: 0,1 µg L^-1;
	Adição de padrão deuterado (AFM-d₅);		Coluna: Supelcosil LC-18-DB (75 mm x 3,0 mm i.d., 3 µm, Supelco^®);	LOQ: não informado;
	Amostra acidificada com ácido fórmico (0,1 M).		Fases Móveis: Ácido Fórmico 20 mM e MeOH;	Coeficiente de variação intra-dia e inter-dia: 1,3% e 2,6%, respectivamente;
			Fluxo: 0,5 mL/min;	Linearidade da Curva de Calibração: 1–100 µg L^-1.
			SRM- AFM: 238→109; AFM-d₅: 243→114.
Sabatini et al.⁽²⁹⁾	Estocagem: -20 ºC;	Extração por Fase Sólida (SPE)	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): não informado;
	Centrifugação a 1500 X g por 10 min;	Cartucho Evolute^TM ABN (25 mg, 1 mL);	Ionização em modo negativo;	LOD: 0,30 µg L^-1;
	Amostra diluída e dopagem com padrão deuterado (AFM-d₅).	Extrato evaporado à secura sob vácuo e temperatura de 40 ºC;	Coluna: Synergi 4u Max-RP (0.5 mm x 50 mm i.d., 4 µm, Phenomenex^®);	LOQ: 0,60 µg L^-1;
		Resíduo redissolvido com 50 µL de uma solução de 20 mM de ácido fórmico e metanol 1:1 (v/v).	Fases Móveis: A: Ácido Fórmico 20 mM; B: MeOH;	Coeficiente de variação médio intra-dia e inter-dia: 6,0% e 4,9%, respectivamente;
			Fluxo: 10 µL/min;	Linearidade da Curva de Calibração: 0,6–50 µg L^-1;
			MRM- AFM: 238→109; AFM-d₅: 243→114.	R²: > 0,999.
Ding et al.⁽⁷⁰⁾	Estocagem: -70 ºC;	Não foi realizada. Realizou-se injeção direta.	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): não informado
	Amostra diluída (com ácido acético 0,5%) e dopada com padrão deuterado (AFM ¹³C₆).		Ionização em modo negativo;	Precisão média: 3,5%
			Coluna: Xterra C18 MS (50 x 4,6 mm i.d., 5µm, Waters^®);	Acurácia média: 102%
			Fases móveis: Ácido Acético 0,5% e ACN;	LOD: 0,01 µg L^-1;
			MRM- AFM: 238→109; AFM ³C₆: 244→115.	LOQ: 0,025 µg L^-1;
				Coeficiente de variação intra-dia e inter-dia: 2,8% e 8%, respectivamente;
				Faixa Linear da Curva de Calibração: 0,025-25 µg L^-1;
Sterz et al.⁽⁵⁶⁾	Estocagem: congelada, temperatura não informada;	Extração por Fase Sólida (SPE)	LC- APCI-MS/MS	Nenhum dado foi informado.
	Amostra dopada com padrão deuterado (AFM-d₅), novamente congelada para a liofilização;	Cartucho SeQuant ZOC^® HILIC (500 mg);	Ionização modo negativo;
	Resíduo redissolvido em MeOH e ACN.	Extrato levado à secura a vácuo em temperatura ambiente;	Coluna: Atlantis^® HILIC Silica (3 µm, Waters^®);
		Resíduo redissolvido com 200 µL de MeOH.	Fases Móveis: Solução aquosa de Acetato de Amônio 5mM, e ACN com acetato de amônio 5 mM;
			Fluxo: 400 µL min^-1;
			MRM- AFM: 238→109; AFM-d₅: 243→114;
			Determinação do Pré-AFM (MRM: 256→109).
NIOSH⁹ B’Hymer⁽⁷⁴⁾	Estocagem: -20 ºC;	Extração por Fase Sólida (SPE)	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): 102-106;
	Amostra dopada com padrão deuterado (AFM-d₅).	Cartucho: Bond Elut C18 (500 mg, Varian);	Ionização modo negativo;	LOQ: 0,2 µg L^-1
		Eluição dos analitos do cartucho com 3 x 3 mL de acetona;	Coluna: Zorbax Rx C18 (150 x 3,0 mm i.d., 3,5 µm);	Linearidade da Curva de Calibração: 0,5-50 µg L^-1
		Extrato levado à secura;	Fases Móveis: ACN:água:ác. acético (5/95/0,1, v/v) e ACN:água:ác. acético (75:25:0,1, v/v);	R²: > 0,99
		Resíduo redissolvido com 1 mL de mistura de ACN:água:ác. acético (5/95/0,1, v/v).	Fluxo: 0,3 mL/min;	Desvio Padrão: < 1,0 µg L^-1
			SRM- AFM: 238→109; AFM-d₅: 243→114.	Desvio Padrão relativo: 2-5%
Jones e Mccallum⁽⁶⁴⁾	Estocagem: congelada, temperatura não informada;	Extração por Fase Sólida (SPE)	LC-ESI-MS/MS	Faixa Linear da Curva de Calibração: até 500 nmol/L;
	Urina acidificada (com 200 µL HCl 6M) e dopada com padrão deuterado (SBMA-d₇)	Cartucho C18 (100 mg);	Ionização em modo negativo;	LOQ: 10 nmol/L;
		Extrato evaporado à secura;	Coluna: Synergi Hydro-RP 80A (150 x 2 mm i.d., 4 µm, Phenomenex^®);	LOD: 2 nmol/L;
		Resíduo redissolvido com 100 µL (acetato de amônio 20 mM com 0,1% de ácido acético e MeOH, 70:30, v/v).	Fases Móveis: Acetato de Amônio 20 mM com 0,1% de ácido acético e MeOH;	Coeficiente de variação inter-dia: 13%.
			Fluxo: de 0,2 mL/min;
			MRM- AFM: 238→109; SBMA-d₇: 259→130.
Alwis et al.⁽²⁰⁾	Estocagem: -70 ºC;	Não foi realizada. Realizou-se injeção direta.	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): 90-102;
	Amostra tamponada (com acetato de amônio 15 mM e pH 6,8) e dopada com padrão deuterado (AFM ¹³C₆).		Ionização em modo negativo;	LOD: 0,3 µg L^-1;
			Coluna: Acquity UPLC^® HSS T3 (150 x 2,1 mm i.d., 1,8 µm, Waters^®);	LOQ: 0,5 µg L^-1;
			Fases Móveis: ACN e solução de Acetato de Amônio 15 mM e pH 6,8;	Faixa Linear da Curva de Calibração: 0,03-14 µg L^-1;
			Fluxo: de 0,25 a 0,3 mL/min;	R²: > 0,99;
			SMRM- AFM: 238→109; AFM ³C₆: 244→115.	Coeficiente de Variação inter-dia: < 11%;
				Supressão Iônica: < 1%.
Borgie et al.⁽⁵⁸⁾	Estocagem: -80 ºC;	Extração por Fase Sólida (SPE)	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): não informado;
	Amostra diluída, tamponada e dopada com padrão deuterado;	Cartucho Oasis^® MAX (3 cc/ 60 mg, Waters^®);	Ionização em modo negativo	LOD: não informado;
	Homogeneização e centrifugação a 5000rpm.	Extrato evaporado à secura;	Coluna: Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm i.d., 1,7 µm, Waters^®);	LOQ: 1 µg L^-1;
		Resíduo redissolvido com 0,1 ml de uma solução de ácido fórmico 0,1% e ACN (95:5, v/v).	Fases Móveis: ACN e Ácido Acético 0,01%;
			Fluxo: 0,4 mL/min;
			SRM- AFM: 238→109.
Zhang et al.⁽⁶⁷⁾	Estocagem: -80 ºC;	Extração Online	LC-ESI-MS/MS	Rec (%): > 90
	Centrifugação a 10.000 rpm por 5 min;	LiChrospher^® RP-8 ADS (24 x 4 mm i.d., 25 µm, Merck)	Ionização modo negativo;	LOD: 0,013 µg L^-1
	Amostra dopada com padrão deuterado (AFM-d₅) e tamponada a pH 2,5;	Fase móvel: Solução aquosa de ácido fórmico 0,05%.	Coluna: Zorbax Eclipse XDB C18 (2,1 x 150 mm i.d., 3,5 µm, Agilent);	LOQ: 0,043 µg L^-1
	Filtração com membrana de 0,22 µm.		Fases Móveis: ACN e Solução aquosa de ácido fórmico 0,05%;	Faixa Linear da Curva de Calibração: 0,1-20 µg L^-1 e
			Fluxo: 0,25 a 0,3 mL/min	R²: > 0,99
			SRM- AFM: 238→109; AFM-d₅: 243→114.	Coeficiente de variação intra-dia e inter-dia: 0,7-5% e 1,7-4,4%, respectivamente.

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[TFN1] ACN: acetonitrila

[TFN2] AFM: ácido S-fenilmercaptúrico

[TFN3] GC-MS: cromatografia a gás com detecção por espectrometria de massas

[TFN4] LC-APCI-MS/MS: Cromatografia a líquido com detecção por espectrometria de massas em tandem e ionização química à pressão atmosférica

[TFN5] LC-ESI-MS/MS: Cromatografia a líquido com detecção por espectrometria de massas em tandem e ionização por electrospray

[TFN6] LOD: limite de detecção do método

[TFN7] LOQ: limite de quantificação do método

[TFN8] MeOH: metanol

[TFN9] MRM: monitoramento de reações múltiplas

[TFN10] Rec: recuperação do método

[TFN11] SBMA: ácido S-benzilmercaptúrico

[TFN12] SRM: monitoramento de reações selecionadas