FREQUENT ANALYTICAL QUESTIONS (FAQ) - 20 DÚVIDAS COMUNS EM QUÍMICA ANALÍTICA

FREQUENT ANALYTICAL QUESTIONS (FAQ) - 20 COMMON QUESTIONS IN ANALYTICAL CHEMISTRY

Resumo

Twenty frequently asked questions in analytical chemistry are presented in a clear, instructive, and accessible manner. In the context of classical analysis, the text addresses questions related to types of solutions and their preparation, as well as key definitions of qualitative and quantitative methods, volumetric analysis, and heavy metals. It also covers essential topics such as analytical sequence, use of certified reference materials, distinctions among analytical methods, procedures, and techniques, and the main analytical figures of merit. Finally, fundamental aspects of instrumental analysis - including noise, background signals, detectability, detection and quantification limits, and calibration - are discussed, along with statistical considerations related to precision, linear modeling, and significance testing.

INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, a Química Analítica no Brasil tem experimentado uma notável expansão, impulsionada pela criação de novos grupos de pesquisa em diferentes regiões do país, pela formação contínua de recursos humanos altamente qualificados e pelas contribuições cada vez mais expressivas e de elevado impacto na literatura científica mundial. Atuando como um importante pilar para aplicações nas mais diversas áreas, as contribuições analíticas nacionais têm se destacado principalmente nas vertentes de preparo de amostras, automação, metrologia química, quimiometria, química verde, técnicas de microextração e técnicas de análise direta.

No âmbito da formação acadêmica, evidencia-se a necessidade contínua de retomar e consolidar conceitos fundamentais da Química Analítica, uma vez que eles se manifestam de forma recorrente em apresentações de trabalhos e defesas. Alguns fatores podem explicar esse cenário, como a ausência de consenso ou de uniformização dos fundamentos, a demanda por atualização diante de novas descobertas e terminologias propostas, além da dispersão das informações em múltiplas referências bibliográficas. Além disso, muitas dessas informações são encontradas em idioma estrangeiro e/ou com linguagem científica mais avançada, o que torna o aprendizado desses conceitos pouco palatável aos iniciantes na área.

O objetivo deste trabalho é elaborar um compêndio reunindo uma seleção de vinte dúvidas frequentes na área de Química Analítica, apresentando respostas em português, de forma didática, acessível e acompanhadas de referências que permitem ao leitor aprofundar-se em cada tópico. Inspirado em outros trabalhos publicados na Química Nova como “Estatística aplicada à química: dez dúvidas comuns”¹ e “25 anos de quimiometria no Brasil”,² o presente trabalho visa contribuir para a formação de recursos humanos qualificados, reduzindo barreiras conceituais e linguísticas, favorecendo a compreensão de temas essenciais tanto para estudantes em formação quanto para profissionais em processo de atualização.

As questões levantadas abrangem fundamentos de Química Analítica clássica e instrumental. Análises clássicas envolvem o emprego de reações químicas e medidas de massa (gravimetria) ou volume (volumetria), destacando-se por sua simplicidade, boa exatidão e menor custo, apesar de serem geralmente mais lentas e menos sensíveis. Já as análises instrumentais empregam equipamentos para medir propriedades físico-químicas do analito, oferecendo maior sensibilidade, rapidez e possibilidade de análises multicomponentes, embora demandem maior investimento e capacitação. Cabe ressaltar que essas duas vertentes são complementares e fundamentais na formação de cientistas na área de Química Analítica.

Buscou-se também abordar aspectos práticos sobre a sequência analítica, esclarecer equívocos como na definição do termo “metais pesados” e tornar mais compreensivo o uso de materiais de referência certificados. Outras questões envolvem conceitos essenciais de Estatística e Metrologia voltadas a análises químicas. Aspectos teóricos e práticos sobre sinal de fundo, ruído, erro, desvio padrão, variância, intervalo de confiança, regressão, calibração e testes estatísticos são abordados de maneira simples e didática. Por fim, princípios de validação analítica relacionados à exatidão, precisão, linearidade, sensibilidade, seletividade e outros são abordados neste manuscrito.

1. QUAL A DIFERENÇA ENTRE ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA?

A classificação das análises químicas em qualitativa e quantitativa é fundamentada no objetivo da análise. Quando o objetivo é identificar se elementos ou compostos estão presentes em uma amostra, a análise é chamada de qualitativa. Quando o objetivo é determinar a quantidade ou massa de um elemento ou composto em uma amostra, a análise passa a ser referida como quantitativa, indicando que o objetivo da análise concerne a quantidades, ou seja, à estimativa de quantidades numéricas acerca da espécie de interesse. Assim, a pergunta a se fazer na análise qualitativa é “O que está presente?”, enquanto na análise quantitativa devemos nos perguntar “Quanto está presente?”.

Formalmente, a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)³ define análise qualitativa como “análises em que as substâncias são identificadas ou classificadas com base em suas propriedades químicas ou físicas, tais como reatividade química, solubilidade, massa molecular, ponto de fusão, propriedades radioativas, espectros de massa, tempo de meia-vida, etc.” As análises quantitativas se referem às “análises nas quais a quantidade ou concentração de um analito pode ser determinada (estimada) e expressa como um valor numérico em unidades apropriadas.”⁴

No ensino de Química Analítica, a análise qualitativa é comumente empregada para a identificação de cátions, principalmente através de reações em via úmida e procedimentos sequenciais de separação e de identificação, conhecidos como análise sistemática ou coloquialmente, como “marcha analítica”. A sequência é baseada no método desenvolvido por Fresenius⁵-⁷ em 1840 e, embora não seja utilizada rotineiramente, sua aplicação em cursos de nível técnico e superior está relacionada à formação de profissionais que atuarão na área de Química e em áreas correlatas. Diversos estudos⁵-⁷ já apontaram a importância da sequência analítica e da discussão dos equilíbrios envolvidos para a formação de Químicos.

Cabe ressaltar que métodos que empregam técnicas analíticas instrumentais também podem, e são usados, em análise qualitativa em métodos rotineiros ou em atividades de pesquisa. Além disso, a análise qualitativa pode ser realizada sem a análise quantitativa. Por outro lado, o inverso não é verdadeiro, de tal maneira que, para conduzir uma análise quantitativa, normalmente é necessário primeiro identificar os analitos, com raras exceções.

2. O QUE É UM PROBLEMA ANALÍTICO E QUAIS AS ETAPAS QUE COMPÕEM A SEQUÊNCIA ANALÍTICA?

Um dos principais objetivos da Química Analítica é a proposição ou o desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação qualitativa e/ou quantitativa de elementos ou compostos presentes em uma amostra. Normalmente, várias etapas são necessárias para se alcançar esse objetivo, incluindo processos de amostragem, preparo de amostra, calibração, medida analítica e tratamento estatístico, entre outras etapas. O conjunto dessas etapas compõe a chamada sequência analítica.

O número e quais são as etapas que integram a sequência analítica podem variar de acordo com a fonte bibliográfica consultada. No entanto, uma sequência amplamente aceita contém as etapas: definição do problema analítico, escolha do método de análise, amostragem, tratamento da amostra e separação, calibração, medidas analíticas, avaliação dos resultados e, finalmente, a ação.⁸ Cabe ressaltar que nem todas essas etapas são necessárias em todos os métodos analíticos e que a sequência não é fixa, podendo ser ajustada de acordo com as particularidades de cada estudo.

Para a seleção adequada das estratégias a serem adotadas em cada uma das etapas, a primeira etapa, e talvez a mais importante, é a proposição do problema analítico a ser solucionado. De acordo com Valcárcel e Ríos,⁹ o problema analítico pode ser entendido como uma demanda de informação química qualitativa, quantitativa ou estrutural, originada de um contexto socioeconômico, técnico-científico ou de uma necessidade de inovação metodológica em Química Analítica. Assim, a formulação do problema envolve a identificação de necessidades que possam ser solucionadas por meio de operações analíticas, convertendo o problema inicial em um objetivo analítico. Nessa etapa, deve-se reunir o máximo de informações disponíveis sobre a natureza do problema, visto que as decisões subsequentes dependem de fatores como o tipo de amostra, o(s) analito(s) de interesse, os métodos disponíveis e os requisitos de precisão e exatidão.⁸-¹⁰ Exemplos de problemas analíticos incluem a determinação da quantidade de poeira ingerida por crianças como indicador de exposição a material particulado, o estudo da toxicidade de polímeros perfluorados e o desenvolvimento de sensores rápidos e sensíveis para detecção de agentes químicos e biológicos.¹¹

A partir da definição da informação analítica desejada, procede-se à escolha do método analítico, tomando-se a cautela de garantir a compatibilidade entre o preparo de amostra e a técnica analítica de medição. Uma estratégia conveniente consiste em escolher primeiro a técnica de detecção, para então definir os procedimentos de coleta e preparo da amostra. A escolha do método depende não apenas da natureza da amostra e do analito, mas também de restrições práticas, como tempo disponível, custo e infraestrutura laboratorial. Espectrometria de massas, por exemplo, é uma técnica analítica capaz de realizar a determinação analítica de vários analitos, no entanto, um espectrômetro de massas não é um equipamento que está disponível em todos os laboratórios. Então, a escolha também deve ser adequada aos recursos disponíveis.

Uma vez definido o método, a próxima etapa é a obtenção de uma amostra no processo de amostragem, o qual se refere à obtenção de uma pequena quantidade de material que seja suficientemente representativa de todo o material de interesse. A amostragem pode ser uma etapa complexa, especialmente quando o material a ser amostrado é heterogêneo, existindo diversas estratégias a depender do problema analítico. A amostragem, necessariamente, envolve estatística, uma vez que a partir dos resultados obtidos para a amostra será feita uma inferência para obter conclusões sobre o todo.¹⁰

De posse da amostra laboratorial, a próxima etapa consiste no tratamento da amostra e/ou separação da espécie analítica de interesse. Nessa etapa, a amostra deve ser convertida em uma forma compatível com a técnica analítica a ser utilizada. Por exemplo, na maioria dos casos, as amostras são analisadas na forma de soluções aquosas, o que significa que amostras sólidas devem ser convertidas em uma solução homogênea, exceto quando são empregados métodos que permitem a análise direta de sólidos. Além disso, é preciso considerar que a maioria dos métodos analíticos são seletivos, isto é, respondem à presença de mais de uma espécie, ao contrário de métodos específicos, os quais responderiam à presença de uma única espécie. Desta maneira, a presença de possíveis interferentes deve ser avaliada, sendo muitas vezes necessário extrair o analito ou os interferentes. Deve-se também assegurar a estabilidade da espécie de interesse, especialmente quando o analito é uma espécie química específica, como requerido em análise de especiação.⁸,¹²

A análise da amostra, por sua vez, gerará uma resposta (medida analítica) de uma propriedade química ou física do analito. Idealmente, a propriedade medida está relacionada de maneira diretamente proporcional à concentração através de uma constante de proporcionalidade, a qual é obtida experimentalmente com a realização da calibração analítica. A maioria dos métodos empregados em Química Analítica são relativos e, dependem da calibração analítica para a quantificação do analito.¹⁰

A próxima etapa consiste na avaliação dos resultados, com a condução de cálculos da concentração do analito a partir dos resultados experimentais, incluindo-se toda sequência de operações realizadas com a amostra e análise estatística com a estimativa de sua confiabilidade. Finalmente, na última etapa, tem-se a ação, ou seja, a tomada de decisão baseada nas informações fornecidas pelos resultados analíticos, permitindo a resolução do problema analítico inicialmente proposto.

Mais uma vez, convém ressaltar que a sequência analítica deve estar centrada na resolução do problema analítico e a cada dia novos problemas são propostos para atender às crescentes demandas tecnológicas, grande quantidade de dados e às inovações das mais variadas áreas. Assim, a Química Analítica, e o seu mercado, estão em constante evolução. Estima-se que o tamanho e a participação de mercado somente de instrumentação analítica movimentem um montante de 59 bilhões de dólares em 2026, com expectativas de que esse mercado alcance a marca de 82 bilhões de dólares até 2031, sendo uma área em franca expansão. Tamanho crescimento se deve, principalmente, à regulamentações mais rigorosas quanto à presença de contaminantes, fabricação de nanomateriais e demandas da indústria farmacêutica para testes de liberação em tempo real.¹³

3. QUAL A DIFERENÇA ENTRE TÉCNICA, MÉTODO, PROCEDIMENTO E PROTOCOLO ANALÍTICO?

Uma técnica é baseada em um princípio químico ou físico que pode ser aplicado para quantificar um analito. Por exemplo, para determinar o total de chumbo em amostras aquosas, é viável empregar a técnica de espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (graphite furnace atomic absorption spectrometry, GFAAS). Nessa condição, íons de chumbo em meio aquoso são inicialmente convertidos em átomos livres (atomização, um processo químico). Em seguida, a potência de radiação na região do ultravioleta-visível absorvida por esses (processo físico) é relacionada à sua concentração.¹⁴ Assim, uma técnica é um princípio científico que se mostra útil para fornecer informações composicionais.¹⁵

Um método, por sua vez, trata-se da aplicação de uma técnica para a determinação particular de um analito específico em uma matriz específica, muitas vezes associada a processos de preparo de amostra, a fim de eliminar interferências. Exemplificando, a aplicação da GFAAS para determinar a concentração de chumbo em águas é um método diferente de GFAAS para chumbo em solos.¹⁴,¹⁵ Assim, um método envolve uma sequência de etapas, que incluem o objetivo da análise, amostragem, pré-tratamento da amostra, medida analítica, interpretação de resultados e conclusão. Em outras palavras, um método é uma abordagem ampla para resolver um problema analítico, enquanto uma técnica é um recurso específico, baseado em um fenômeno físico ou químico, usado dentro desse método.

Um procedimento consiste em um conjunto de instruções escritas que orientam a aplicação de um método. Essas instruções incluem diretrizes sobre a coleta da amostra, o tratamento de possíveis interferentes e a validação dos resultados. Um mesmo método pode apresentar diferentes procedimentos, à medida que analistas ou instituições os adaptam às necessidades particulares.¹⁴

Já um protocolo corresponde a um conjunto de diretrizes rigorosas que definem o procedimento a ser seguido pelo analista para que os resultados sejam oficialmente aceitos por uma agência. Protocolos são especialmente relevantes quando os resultados da análise subsidiam ou orientam políticas públicas. No caso da determinação da concentração de chumbo em água, por exemplo, o analista deve adotar o protocolo estabelecido pela Environmental Protection Agency (EPA).

Esses conceitos evidenciam uma hierarquia entre os quatro níveis de metodologia analítica, como ilustrado na Figura 1. Idealmente, um protocolo fundamenta-se em um procedimento previamente validado. Antes de elaborar e validar um procedimento, é necessário selecionar o método de análise, o que exige uma triagem inicial das técnicas disponíveis para identificar aquelas com maior potencial para monitorar o analito.¹⁴

Figura 1
Diagrama ilustrativo para diferenciação entre técnica, método, procedimento e protocolo analítico

4. COMO PREPARAR UMA SOLUÇÃO E CALCULAR AS INCERTEZAS ASSOCIADAS?

O preparo de soluções envolve procedimentos experimentais em que medidas de volume e massa são frequentemente utilizadas. Em ambos os casos, instrumentos específicos são empregados, como balanças para pesagem e materiais volumétricos como buretas, provetas, pipetas, balões volumétricos e béqueres, para conter ou transferir volumes. Como toda medida experimental, o valor medido possui uma incerteza inerente - também conhecida como erro - e a magnitude da incerteza depende do tipo de instrumento. Uma bureta de 50,00 mL, por exemplo, possui incertezas típicas de ± 0,05 mL ou ± 0,10 mL, enquanto um béquer de 50 mL, de ± 1 mL. O erro percentual da medida pode ser calculado pela fórmula: (incerteza / valor medido) × 100%. Isso significa que, se um volume de 10 mL for medido com esses dois instrumentos, os erros serão de 0,5 e 10% na bureta e no béquer, respectivamente. Esse mesmo conceito pode ser aplicado a todo tipo de medida experimental, bastando conhecer a incerteza do instrumento e o valor medido. É importante ressaltar que a incerteza depende do tipo e do volume do instrumento volumétrico e deve ser sempre consultada para a correta expressão no resultado.

O próximo passo que deve ser levado em consideração quando calculamos as incertezas envolvidas no preparo de soluções é a propagação dessas quando adicionamos etapas no processo. Um exemplo simples é o cálculo do erro percentual envolvido no preparo de uma solução, de concentração expressa em g mL^-1, a partir da pesagem de 1,0000 g de uma substância química em uma balança, com incerteza de ± 0,0001 g, seguida pela dissolução em 100 mL de água em um béquer que possui incerteza de ± 1 mL. Nesse caso, o cálculo da concentração envolve a divisão da massa pelo volume e, consequentemente, a propagação da incerteza deve ser considerada a partir dessa operação matemática (divisão). Para se obter a incerteza que é propagada nessas duas operações (medidas de massa e de volume), deve-se utilizar uma fórmula de propagação de incertezas que relaciona as incertezas e valores medidos individuais e o tipo de operação matemática envolvida. A Tabela 1 apresenta um resumo das fórmulas de propagação de incertezas em função da operação matemática empregada. A demonstração dessas fórmulas está além do escopo dessa discussão, mas pode - e deve - ser vista com detalhes em um ótimo artigo recentemente publicado.¹⁶ Ao aplicar a fórmula de propagação de incertezas no exemplo anterior, a concentração obtida é 1,00 × 10^-2 g mL^-1 e a incerteza é de ± 1,00 × 10^-4 g mL^-1. Consequentemente, o erro percentual envolvido no preparo dessa solução é de 1%. Se, no preparo desta mesma solução, fosse utilizado um balão volumétrico de 100,0 mL com incerteza de ± 0,01 mL, o erro percentual seria de 0,01%. Verifica-se, portanto, que ao utilizarmos instrumentos com incertezas menores, a solução preparada possuirá erro percentual menor.

Tabela 1
Resumo das fórmulas utilizadas para cálculos de propagação de incerteza

Função	Incerteza (ey)
y = x1 + x2	$e_y=\sqrt{e_{x1}^2+e_{x2}^2}$
y = x1 - x2	$e_y=\sqrt{e_{x1}^2+e_{x2}^2}$
y = x1 × x2	$e_y=y\sqrt{{\left(\frac{e_{x1}}{x_1}\right)}^2+{\left(\frac{e_{x2}}{x_2}\right)}^2}$
y = x1/x2	$e_y=y\sqrt{{\left(\frac{e_{x1}}{x_1}\right)}^2+{\left(\frac{e_{x2}}{x_2}\right)}^2}$
y = xa	ey = |a|ex
y = log x	$e_y=0,434\frac{e_x}{x}$
y = ln x	$e_y=\frac{e_x}{x}$
y = 10x	ey = y ln 10 ex
y = ex	ey = yex

Entretanto, é preciso muito cuidado com essa conclusão para que não haja generalizações e repetições de procedimentos sem que o contexto seja considerado. Para discutirmos de maneira mais sóbria sobre preparo de soluções e incertezas, é fundamental que deixemos claro que devemos considerar dois tipos de solução: uma que podemos chamar de solução de concentração “aproximada”, como, por exemplo, uma solução tampão, e outra que é uma solução padrão. É essencial distinguir entre esses dois tipos de solução antes de ir ao laboratório e selecionar as ferramentas necessárias. No preparo de uma solução de concentração aproximada, como uma solução tampão, é aceitável que um erro percentual maior seja obtido em contrapartida de uma maior rapidez e facilidade no procedimento experimental. Dessa forma, a utilização de uma balança semi-analítica (mais acessível) e de um béquer (maior simplicidade) pode ser adotada no preparo sem causar nenhum prejuízo considerável, visto que não há necessidade de baixas incertezas nas concentrações obtidas.

Por outro lado, o raciocínio inverso deve ser adotado quando preparamos soluções padrão, que, por definição, são soluções em que a concentração é conhecida com exatidão. Para isso, deveremos sempre utilizar instrumentos que forneçam menores incertezas, como no caso de uma balança analítica e um balão volumétrico calibrados e aferidos. Um erro percentual grande nesta etapa trará prejuízo considerável na calibração, precisão, exatidão e aplicação do método. Cabe ressaltar que, além da utilização dos instrumentos adequados, o químico (analítico ou não) deve conhecer e seguir as técnicas e procedimentos de utilização, como “tara”, estabilização e dispositivos adequados de pesagem para a balança, além de processos de ambientação, verificação de meniscos, influência e correção de fatores ambientais, como a temperatura, e transferências de volumes.

Por fim, é fundamental que uma última discussão seja levantada, pois é um erro bastante comum verificado em laboratórios. A solução padrão pode ser preparada por pesagem e dissolução em um volume adequado apenas quando estamos utilizando compostos químicos que se classificam como padrão primário. Nesse caso, o uso dos instrumentos citados anteriormente se justifica. Entretanto, vários métodos analíticos utilizam soluções de analitos que não são padrão primário. Neste caso, a solução preparada deve ser padronizada antes de sua utilização como solução padrão e, por isso, a solução preparada inicialmente - ou seja, antes da padronização - também é uma solução de concentração aproximada. Por isso, não há necessidade da utilização de instrumentos de menor incerteza para o preparo de soluções que serão padronizadas. Um exemplo clássico é o preparo de uma solução de ácido clorídrico que será utilizada como titulante na análise volumétrica. O uso de (micro)pipetas e balões volumétricos para o preparo de solução de HCl não se justifica, visto que, independentemente da incerteza do instrumento de medida, o próprio HCl possui grande incerteza em sua composição (35-37%, como mencionado nos rótulos!). Portanto, é muito mais adequado, em termos de facilidade experimental, preparar uma solução de HCl utilizando uma proveta e um béquer e, posteriormente, proceder com o imprescindível processo de padronização.

5. QUAL A DIFERENÇA ENTRE SOLUÇÃO PADRÃO, SOLUÇÃO ESTOQUE E SOLUÇÃO DE TRABALHO?

Uma solução padrão é aquela em que a concentração do analito (soluto) é conhecida com exatidão e precisão, isto é, com confiabilidade. Nesta definição, é possível fazer a ligação com o uso de algarismos significativos: a concentração de uma solução padrão deve ser sempre expressa com o máximo de algarismos significativos que os instrumentos utilizados para seu preparo fornecem. Geralmente, essas concentrações são expressas com, pelo menos, 4 algarismos significativos, ao contrário de uma solução de concentração aproximada, que utiliza 1 ou 2. Neste ponto, o(a) estudante de química analítica deve perceber a diferença entre uma solução de concentração 0,1 mol L^-1 (solução de concentração aproximada) e 0,1000 mol L^-1 (solução padrão).

Após a definição, a próxima etapa é entender em quais contextos a solução padrão pode ser preparada, direta ou indiretamente. Em alguns casos, soluções padrão são preparadas a partir da pesagem (transferência de volume implicaria em padrão primário líquido) da substância e dissolução em um volume conhecido de solvente utilizando um instrumento volumétrico adequado, como um balão volumétrico. Esse tipo de substância é denominado padrão primário, e possui alguns requisitos para ser assim classificado: possuir pureza elevada e conhecida, ser estável, não se decompor quando é estocado ou aquecido e não ser higroscópico. Portanto, uma solução padrão pode ser preparada a partir da pesagem e dissolução de um padrão primário, como, por exemplo, biftalato de potássio, carbonato de sódio e nitrato de prata. No caso de substâncias que não possuem as características necessárias para serem consideradas padrões primários, a solução preparada não é uma solução padrão. Nesse cenário, esta solução deve ser padronizada. O termo “padrão secundário” também se aplica a esse tipo de substância. Nesse caso, a solução é padronizada utilizando uma solução de padrão primário, por meio da aplicação da técnica de titulometria, por exemplo. São exemplos de padrões secundários: ácido clorídrico, hidróxido de sódio e ácido sulfúrico.

Dentre as soluções padrão comercialmente disponíveis, destacam-se as soluções contendo íons metálicos. De forma geral, elas apresentam elevada confiabilidade, com incertezas típicas entre ± 0,1% e ± 1,0%, sendo a concentração total do elemento certificada com rastreabilidade a padrões primários. É importante ressaltar que, na maioria dos casos, a confiabilidade se refere ao teor do elemento metálico, e não ao estado de oxidação ou à forma química que se apresenta.

Nas etapas de desenvolvimento e calibração de métodos analíticos instrumentais, é essencial o preparo e emprego de solução padrão. Via de regra, uma solução de concentração mais elevada - geralmente em torno de 1 a 0,001 mol L^-1 - é preparada e estocada de maneira apropriada. Para análises elementares é comum o uso de soluções de 1.000 mg L^-1. Esta solução é denominada solução estoque e, na maioria das vezes, é preparada em volumes maiores (e.g., acima de 50,00 mL) e estocada na geladeira (em frascos adequados e não em balões volumétricos, um erro comum em diversos laboratórios!). Soluções de concentração menores, usualmente utilizadas na etapa de calibração e na ordem de milie micromol L^-1, são preparadas por diluição a partir da solução de trabalho. Essas soluções são chamadas de soluções de trabalho e devem ser preparadas no mesmo dia de sua utilização.

Resumidamente, a solução padrão é aquela que possui concentração conhecida com exatidão e com rastreabilidade assegurada. Solução estoque é uma solução geralmente mais estável e concentrada que será utilizada em diluições futuras (podendo esta ser relativa a um padrão ou não). As soluções de trabalho são menos estáveis e preparadas por diluição (a partir de uma solução estoque) com maior frequência, para uso imediato em uma análise.

6. O QUE SÃO “METAIS PESADOS”?

O termo “metal pesado” vem sendo historicamente usado, desacertadamente, como sinônimo de metais tóxicos ou de contaminantes. É comum, por exemplo, ler frases do tipo “Laudo aponta contaminação de água de rio com metais pesados” em reportagens ou em trabalhos científicos. Ou, se deparar no laboratório com frascos de descarte etiquetados como sendo para “metais pesados”. Assim, há uma forte tendência na sociedade e na comunidade científica em assumir que todos os “metais pesados” seriam altamente tóxicos ou ecotóxicos.

Desmembrando os termos “metal” e “pesado”, o termo “metal” refere-se ao elemento puro ou a uma liga de elementos metálicos, enquanto o termo “pesado” refere-se a metais que apresentam alta densidade. Desta maneira, a combinação de ambas as palavras, quando interpretadas de acordo com os seus significados terminológicos, não faz qualquer menção a possíveis efeitos tóxicos ou de poluição. Além disso, não há nenhuma correlação conhecida entre a densidade de um metal e seus possíveis efeitos biológicos em seres vivos. Muitos metais, inclusive sódio, potássio, cálcio, ferro, zinco, cobre, entre outros, desempenham funções essenciais nos organismos vivos em variados níveis de concentração e formas químicas.

Formalmente, a IUPAC¹⁷ não apresenta uma definição para o termo “metal pesado”. Alguns autores tentaram estabelecer critérios para uma possível classificação, embora sem consenso. Hawkes¹⁸ acredita que a expressão “metal pesado” poderia ser usada para se referir aos metais dos grupos 3 a 16 que estão nos períodos 4 ou superiores da tabela periódica, abrangendo os metais de transição e pós-transição, tendo como base as propriedades químicas desses elementos. Foram também sugeridas classificações com base nas massas atômicas e no número atômico. No entanto, nenhuma delas se mostrou consistente, assim como uma possível classificação com base na densidade. Desta maneira, do ponto de vista terminológico e técnico, a utilização da expressão “metal pesado” carece de fundamentação científica, razão pela qual a IUPAC não recomenda seu emprego em qualquer contexto formal.

Além do uso inadequado do termo com conotações de toxicidade, a expressão “metal pesado” também é frequentemente empregada para designar elementos como arsênio e selênio, os quais são semimetais e apresentam um comportamento químico intermediário entre metais e ametais. Tal designação, principalmente quando aplicada para se referir ao arsênio, advém dos efeitos tóxicos observados devido à exposição a esse elemento e às suas espécies, mesmo em baixos níveis de concentração. Nesses casos, o uso do termo “metal pesado” para se referir a esses elementos também é inapropriado em contextos ambientais e toxicológicos.

Outras citações usam o termo “metal pesado” para se referir a elementos em seu estado metálico e suas diferentes formas químicas. Entretanto, o metal no estado metálico e suas espécies químicas apresentam propriedades químicas, físicas e toxicológicas distintas, o que inviabiliza a generalização. O mercúrio, por exemplo, pode ser encontrado em diferentes formas químicas: mercúrio metálico (Hg ou Hg⁰), mercúrio inorgânico (íons Hg²⁺ e Hg₂²⁺) e sob a forma de compostos orgânicos como o metilmercúrio e dimetilmercúrio, sendo essa última a de maior toxicidade, embora todas sejam tóxicas.¹⁹ Também é necessário considerar que o próprio termo “toxicidade” é um conceito relativo. O grau de toxicidade de um elemento ou composto depende de múltiplos fatores, como sua forma química, das concentrações ou doses, do organismo que está sendo exposto, bem como da forma e da duração da exposição, entre muitos outros fatores.

Assim, a inadequação do uso de “metal pesado” para designar um determinado grupo de elementos carece de base científica. A classificação mais usada, baseada em densidade, é incoerente, considerando que densidade e toxicidade não apresentam correlação conhecida. Para designar elementos que podem exercer efeitos tóxicos ou ecotóxicos, mesmo em baixos níveis de concentração, o uso da expressão “elementos potencialmente tóxicos em níveis de traços” pode ser uma alternativa mais adequada.

7. QUAL A DIFERENÇA ENTRE O PONTO DE EQUIVALÊNCIA E PONTO FINAL DA TITULAÇÃO?

Esta é uma diferenciação conceitual importante e comumente confundida entre os estudantes que cursam disciplinas relacionadas à Química Analítica quantitativa clássica. Para compreender a diferença entre ponto de equivalência e ponto final, também referidos como volumes do ponto de equivalência e do ponto final, é fundamental o entendimento de que um conceito é relacionado ao aspecto “teórico” e o outro ao aspecto “prático” da técnica. A titulação é, por definição, a medida do volume que contém a quantidade (número de mols) de um reagente - frequentemente chamado de titulante - necessário para reagir estequiometricamente com um analito (titulado).²⁰ A partir da medida da quantidade do reagente, é possível obter o teor - habitualmente expresso em termos de concentração - do analito. O volume do titulante é medido com o auxílio de uma bureta.

O conceito de ponto de equivalência está relacionado com o volume exato de titulante necessário para que a reação entre reagente e analito seja, estequiometricamente, finalizada. Dessa forma, o volume do ponto de equivalência só pode ser obtido quando se tem informações prévias sobre a concentração do titulante e o número de mols do titulado. Por isso, o ponto de equivalência se relaciona com um aspecto “teórico” da titulação, onde o volume ideal para a reação completa é calculado a partir de dados prévios.

Entretanto, quando a análise titulométrica é aplicada em uma “situação real”, a informação a respeito da quantidade de analito presente na amostra é frequentemente desconhecida, visto que esse é o objetivo do procedimento analítico e, portanto, não se pode inferir previamente o volume do titulante que será consumido. Nesse caso, o volume do titulante necessário para reagir completamente com o titulado é obtido com o auxílio de indicadores, que provocarão uma mudança física (alteração da cor da solução, por exemplo) abrupta quando a relação estequiométrica se estabelece ou o mais próximo possível dessa situação. O ponto final é, portanto, indicado pela mudança de cor do indicador e o volume do titulante necessário para alcançar o ponto final é utilizado para se calcular a concentração do analito.

8. O QUE É CALIBRAÇÃO E QUAIS OS PRINCIPAIS MÉTODOS PARA REALIZÁ-LA?

A maioria dos métodos instrumentais de análise química é baseada em medidas de intensidade de sinal para um conjunto de soluções analíticas com concentrações crescentes e exatamente conhecidas, denominadas padrões (ver questão 5 para maiores detalhes). A determinação do analito em uma amostra desconhecida envolve o estabelecimento de uma função matemática de correlação entre as variáveis, produzindo um gráfico com a concentração (C) no eixo x e a intensidade de sinal (I) no eixo y.²¹ Métodos tradicionais de calibração utilizam a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados para estimar os parâmetros necessários à determinação da concentração do analito nas amostras, como por exemplo, os coeficientes angular (a), linear (b) e de determinação (R²). Dentre os métodos de calibração mais utilizados em Química Analítica destacam-se a calibração externa e sua variante com compatibilização de matriz, padronização interna e adição de padrão ou analito.

A calibração externa (external calibration, EC) é o método mais simples e comumente empregado em análises de rotina. Nesse método, um conjunto de soluções padrão é preparado (normalmente mais do que 5), o que gera menores erros associados ao ajuste linear para determinação da concentração do analito em amostras desconhecidas. Um exemplo prático de calibração externa seria a determinação colorimétrica de Fe^II em leite em pó empregando 1,10-fenantrolina.²² Os padrões de Fe^II são preparados e analisados em ordem crescente (do branco analítico à solução mais concentrada) e os sinais analíticos são utilizados para construir a curva analítica de calibração. Ao final, as amostras reais são analisadas e os sinais são interpolados na curva por meio dos parâmetros de ajuste linear para determinação da concentração (Figura 2a). Uma vez que as medidas de padrões e amostras são realizadas separadamente, as maiores limitações da EC são a suscetibilidade a flutuações que possam ocorrer durante as medidas e a propensão a interferências causadas pela matriz.²³

Figura 2
Métodos tradicionais de calibração empregados em análises químicas instrumentais: calibração externa (a), padronização interna (b) e adições de padrão (c)

Por definição, matriz é o nome dado a todos os componentes de uma amostra, exceto o analito. Como padrões e amostras podem apresentar matrizes com diferentes graus de complexidade, a presença de espécies concomitantes pode causar efeitos distintos de supressão ou potencialização do sinal do analito. Para contornar esse problema, a matriz da amostra pode ser replicada nas soluções padrão, em um processo conhecido como compatibilização de matriz (matrix matching, MM). Um exemplo de aplicação desse método é a determinação de Cd, Fe e Sn em amostras de cachaça por espectrometria de absorção atômica (AAS) em forno de grafite.²⁴ O procedimento de calibração é semelhante ao da calibração externa, entretanto, os efeitos de matriz foram compensados preparando-se os padrões em meio análogo ao da amostra (no caso, 40% v v^-1 etanol). Contudo, essa estratégia é limitada a casos específicos em que se conhece bem a matriz e onde a mesma é facilmente replicável.

A calibração com padrão interno (internal standardization, IS) é um método que se baseia na adição de um elemento ou espécie (denominado padrão interno) em uma quantidade fixa e constante a todas as soluções analíticas, incluindo brancos e amostras. Idealmente, o padrão interno deve possuir propriedades físico-químicas ou características semelhantes às do analito, estar ausente ou em concentração constante nas amostras, ser estável em solução e não interferir na determinação do analito.²⁵ Os sinais do analito e do padrão interno devem ser registrados simultaneamente ou de maneira sequencial rápida. A curva analítica (Figura 2b) é elaborada com base na razão entre o sinal do analito e o sinal do padrão interno (S_A / S_IS). Um exemplo de aplicação desse método é o uso de Ag como padrão interno para determinação de Cu em cachaça por AAS em chama.²⁶ Essa abordagem possibilita uma melhora significativa na precisão e na exatidão, pois tanto o analito quanto o padrão interno são igualmente suscetíveis a interferências, de modo que eventuais variações de sinal são compensadas pelo uso da razão entre os sinais. Apesar de sua utilidade na correção de efeitos de transporte e flutuações instrumentais, a IS é limitada quando se trata de interferências de matriz mais severas.

A calibração por adição de analito ou padrão (standard additions, SA) é um método bastante eficaz para superar ou compensar interferências de matriz. Essa estratégia baseia-se no preparo de um conjunto de soluções analíticas no meio da própria amostra, ou seja, todas as soluções de calibração contêm a mesma quantidade da amostra. Um exemplo de aplicação da SA é na determinação de Na em biodiesel por espectrometria de emissão em chama (flame atomic emission spectrometry, FAES).²⁷ A calibração por adição de analito possibilita garantir que todas as soluções sejam igualmente afetadas por qualquer potencial interferente presente na matriz e é bastante indicada na análise de amostras relativamente complexas, como ambientais, geológicas e biológicas.²⁸ A concentração do analito pode ser determinada por extrapolação gráfica da curva de sinal analítico vs. concentração de analito adicionada; quando a curva intercepta o eixo x (onde o sinal analítico é nulo), o valor obtido é igual ao módulo da concentração do analito na amostra (Figura 2c). Algebricamente, quando S_A = 0, a concentração (em módulo) pode ser obtida pela razão dos coeficientes linear e angular da curva. Apesar das vantagens, a necessidade de construção de uma curva analítica para cada amostra a ser analisada reduz drasticamente a frequência analítica e aumenta o consumo de reagentes e a geração de resíduos.

Mais recentemente, novos métodos de calibração como a análise por diluição de padrão (standard dilution analysis, SDA) e métodos multisinais como as calibrações multi-energética (multi-energy calibration, MEC), multi-isotópica (multi-isotope calibration, MICal), multi-espécies (multi-species calibration, MSC) e multi-vazões (multi-flow calibration, MFC) têm sido alvo de pesquisas e vêm ganhando adeptos devido à sua simplicidade, flexibilidade, eficiência e elevada frequência analítica. Para mais informações sobre calibração com métodos tradicionais e novos, recomendam-se os trabalhos de Donati e Amais²³ e de Carter et al.²⁹

9. QUAL A DIFERENÇA ENTRE COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r) E COEFICIENTE DE DETERMINAÇÃO (R²)?

Durante a execução de um procedimento de calibração, a verificação inicial envolve confirmar se a relação entre sinal analítico e concentração apresenta comportamento linear e, caso isso se comprove, definir os meios adequados para quantificar essa linearidade. Ao empregarmos o método matemático de mínimos quadrados para uma correlação linear entre as variáveis, uma equação da reta do tipo y = a + bx, ou mais especificamente I = a + bC, deve descrever o comportamento das variáveis, onde I é a intensidade de sinal, a o coeficiente linear ou intercepto, b o coeficiente angular ou inclinação e C a concentração do analito. Pensando em um experimento que envolva medidas para 5 soluções padrão, teríamos então C₀ (ou branco), C₁, C₂, C₃ e C₄ e suas respectivas intensidades de sinal medidas, I₀, I₁, I₂, I₃, I₄. A partir desses valores, podemos calcular as médias dos valores de concentração ($\bar{\mathrm{C}}$) e de intensidade ($\bar{\mathrm{I}}$). Em estatística, a métrica que define a força e direção de uma relação linear entre duas variáveis é o coeficiente de correlação produto-momento de Pearson.³⁰ O coeficiente de correlação de Pearson (r) para uma curva analítica com n pontos pode ser calculado pela Equação 1.

(1) $$\mathrm{r}=\frac{\sum _{\mathrm{i}}\left[({\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{C}})({\mathrm{I}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{I}})\right]}{\sqrt{\sum _{\mathrm{i}}\left[{({\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{C}})}^2\right]\sum _{\mathrm{i}}\left[{({\mathrm{I}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{I}})}^2\right]}}$$

O termo que consta no numerador dividido pelo número de pontos, ou seja $\sum _{\mathrm{i}}\left[({\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{C}})({\mathrm{I}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{I}})\right]/n$, é chamado de covariância e mede a variação conjunta de C e I. O termo no denominador também dividido pelo número de pontos, ($\sqrt{\sum _{\mathrm{i}}\left[{({\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{C}})}^2\right]\sum _{\mathrm{i}}\left[{({\mathrm{I}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{I}})}^2\right]}/n$) é o produto dos desvios padrão das variáveis. Como ambos são divididos por n, o coeficiente de correlação de Pearson (r) nada mais é do que o quociente entre a covariância e o produto dos desvios-padrão das variáveis concentração (C) e intensidade de sinal (I). O coeficiente de correlação assume valores entre -1 ≤ r ≤ +1, sendo que o sinal associado mostra a direção de proporcionalidade das variáveis: inversa/declinada (-) ou direta/inclinada (+), e a proximidade do valor unitário indica a força, ou seja, quanto mais próximo de 1, maior a correlação. Por outro lado, valores próximos a 0 mostram baixa ou nenhuma relação linear entre as variáveis.³⁰ Em Química Analítica, o sinal analítico tende a ser crescente com o aumento da concentração, para um dado intervalo de calibração. Com isso, valores de r maiores que +0,99 são tipicamente obtidos. Neste caso, o valor de r indica uma forte correlação entre a concentração do analito e a intensidade de sinal.

O coeficiente de determinação (R²) pode ser calculado elevando-se o valor de r ao quadrado. Nesse caso, precisamos considerar um modelo de ajuste linear baseado no método dos mínimos quadrados. Em linhas gerais, esse parâmetro representa qual a proporção de variância do sinal analítico que pode ser explicada pelos coeficientes calculados para o modelo. Para o caso particular da curva de calibração, esses coeficientes são o linear e o angular. Vale ressaltar que o coeficiente de determinação assume valores entre 0 ≤ R² ≤ 1, independentemente de valores positivos ou negativos de r. Em termos práticos, o R² se traduz em uma forma intuitiva para saber o quão bem o modelo linear se ajusta ao conjunto de dados. Exemplificando, um valor de R² = 0,9980 indicaria que o modelo de ajuste linear consegue explicar 99,80% da variabilidade dos sinais analíticos e que os 0,2% restantes não foram contabilizados.³¹ A Figura 3 mostra um exemplo hipotético de valores de r e R² de acordo com a distribuição dos dados no plano cartesiano. Nas Figuras 3a e 3b nota-se uma forte correlação entre as variáveis e um excelente valor de ajuste das curvas, já nas Figuras 3c e 3d não há uma correlação linear e o ajuste é limitado. É importante enfatizar que valores baixos de r e R² não necessariamente indicam descorrelação entre as variáveis, mas sim uma relação não linear, a exemplo da Figura 3d, onde uma correlação do tipo quadrática é observável.

Figura 3
Valores de coeficiente de correlação linear (r) e de determinação (R²) para curva com relação linear crescente (a), decrescente (b), sem correlação (c) e com correlação quadrática (d)

Uma outra forma de calcular o coeficiente de determinação é através da análise dos valores de soma dos quadrados total (total sum of squares, SQT) e soma dos quadrados dos erros (sum of squared errors, SQE), como exemplificado na Figura 4. A SQT pode ser obtida pelo somatório de todas as diferenças entre os valores de y mensurados (y_i) e o valor médio ($\bar{\mathrm{y}}$), elevadas ao quadrado (Figura 4a). A SQE pode ser obtida pelo somatório de todas as diferenças entre os valores de y provenientes do ajuste linear (ŷ_i) e do valor médio ($\bar{\mathrm{x}}$), elevadas ao quadrado (Figura 4b).

Figura 4
Exemplo de cálculo da soma total dos quadrados (SQT) a partir do valor médio das ordenadas ($\bar{\mathrm{y}}$) (a) e da soma dos quadrados dos erros a partir dos valores médio ($\bar{\mathrm{y}}$) e ajustados (ŷ_i) (b)

O valor de R² pode ser calculado então pela relação destacada na Equação 2.

(2) $${\mathrm{R}}^2=1-\frac{\mathrm{SQE}}{\mathrm{SQT}}$$

Note que o valor de SQT é invariável com relação ao ajuste linear e que a razão SQE / SQT capta justamente os desvios não explicados pelo modelo.³¹ Dessa forma, quanto mais ajustados os pontos estiverem com relação à curva, menor será o valor de SQE e maior o valor de R². Por outro lado, pontos menos ajustados levam a um maior valor de SQE e menores valores de R². Valores de R² próximos a 1 indicam um maior poder explicativo do modelo, enquanto valores próximos a 0 indicam fragilidade explicativa do modelo. Outras informações sobre correlação e modelagem podem ser encontradas em bibliografia especializada.³⁰,³¹

10. QUAL A DIFERENÇA ENTRE DESVIO PADRÃO E INTERVALO DE CONFIANÇA?

Embora muitas vezes usados indistintamente, o desvio padrão e o intervalo de confiança são parâmetros estatísticos diferentes, que expressam a variabilidade, ou a dispersão, de um conjunto de dados. O desvio padrão expressa a precisão de um conjunto de dados, de maneira que valores menores de desvio padrão significam que os dados estão mais próximos entre si, enquanto valores maiores expressam uma maior variabilidade dos dados.¹⁰,²⁰ O desvio padrão da população (σ) é definido matematicamente como:

(3) $$\sigma =\sqrt{\frac{\sum {({\mathrm{x}}_{\mathrm{i}}-\mu )}^2}{\mathrm{N}}}$$

onde: σ é o desvio padrão da população, x_i é a medida ou resultado individual, µ é a média da população e N o número total de medidas ou resultados. Na ausência de erros sistemáticos, µ pode ser considerado como o valor verdadeiro. Assim, o valor de x_i - µ representa a diferença, ou o “desvio”, de cada medida ou observação em relação à média da população.

Uma população compreende, nesse contexto, todo o universo amostral, ou seja, todos os dados de interesse. No entanto, normalmente, realizam-se análises de réplicas da amostra, que é um subconjunto representativo da população,¹⁰ já que a análise de toda a população é, na maioria das vezes, inviável. Considere, por exemplo, a determinação do tamanho dos grãos de areia de uma praia. O número total de grãos de areia (população) é muito alto para ser determinado, sendo impraticável realizar um número tão alto de medidas. Nesse caso, um subconjunto da população (amostra) seria selecionado, seguindo-se os princípios da amostragem.

Quando várias réplicas de uma amostra são analisadas, calcula-se o desvio padrão amostral (s), expresso por:

(4) $$s=\sqrt{\frac{\sum {(x_i-\overline{x})}^2}{N-1}}$$

onde: s é o desvio padrão da amostra, x_i o dado individual, $\bar{\mathrm{x}}$ é a média aritmética dos dados e N o número total de dados. As diferenças entre σ e s são conceitualmente importantes. Para o cálculo de s, a média da população (µ) é substituída pela média da amostra ($\bar{\mathrm{x}}$), enquanto no denominador, considera-se o número de graus de liberdade, estimado por N - 1, que representa o número de dados independentes empregados na estimativa do desvio padrão.¹⁰

O conceito de graus de liberdade pode ser um pouco difícil de ser compreendido, mas pode ser ilustrado por um exemplo simples. Imagine que você precisa preparar uma vitrine para a exibição de pares de sapato para venda e que você dispõe de quatro pares de sapato nas cores preto, marrom, branco e vermelho. A condição é expor pelo menos um par de cada cor. Inicialmente, você tem quatro opções de escolha e escolhe os sapatos brancos. Na segunda escolha, você dispõe de três opções e escolhe o vermelho. Na terceira, você tem duas opções e escolhe os sapatos marrons. Para a última escolha, do quarto par de sapatos, você não tem escolha, já que só restaram os sapatos pretos para satisfazer a condição de ter pelo menos um par de sapatos de cada cor na vitrine. Assim, para as três primeiras escolhas houve liberdade de decisão, enquanto a quarta foi determinada para satisfazer a condição imposta. Então, apesar de existirem quatro pares de sapatos, apenas três escolhas foram livres e o número de graus de liberdade é igual a três.

A maioria das calculadoras científicas e softwares que fazem cálculos estatísticos fornece automaticamente o valor do desvio padrão. No entanto, é necessário ter cuidado para selecionar a opção correta de desvio padrão, de acordo com o tipo de conjunto de dados.³⁰

Outro parâmetro estatístico frequentemente associado ao desvio padrão é a variância, definida como o desvio padrão elevado ao quadrado. Além disso, de posse do desvio padrão, pode-se calcular outros parâmetros que expressam a precisão das medidas, como o coeficiente de variação ou o desvio padrão relativo (relative standard deviation, RSD), que expressa a precisão das medidas em termos percentuais.

O intervalo de confiança (IC) também está relacionado com o desvio padrão e refere-se a uma faixa de valores ao redor da média na qual é provável que o valor verdadeiro esteja contido, com um certo nível de confiança. Para uma população, o IC é expresso como:

(5) $$\text{IC:}\mu =x_i\pm z\sigma$$

onde: µ é a média da população, x_i é um dado individual, z é uma variável estatística atrelada à uma probabilidade e σ é o desvio padrão da população. Assumindo uma distribuição normal, o dado x_i tem probabilidade definida de estar contido no intervalo:

(6) $$\mu -z\sigma <x_i<\mu +z\sigma$$

Por exemplo, para um nível de confiança de 95%, o valor tabelado de z é 1,96. Então, o intervalo será:

(7) $$\mu -1,96\sigma <x_i<\mu +1,96\sigma$$

Esse intervalo significa que há 95% de chance de que o valor do dado x_i esteja contido entre µ - 1,96 σ e µ + 1,96 σ.

Em termos práticos, como quase sempre analisamos um número limitado de réplicas, não estimamos a média verdadeira a partir de uma única medida e o número de dados é insuficiente para estimar σ. Então, substitui-se x_i pela média experimental -x e σ por s/N. Contudo, s raramente pode ser considerada como uma estimativa adequada de σ a partir da análise de um pequeno número de réplicas. Então, intervalos mais amplos são necessários e, para contemplar essa variabilidade, substituímos a variável estatística z por t, conhecida como “t de Student”,¹⁰ a qual está relacionada ao nível de confiança e ao número de graus de liberdade. Tabelas dos valores de z e t podem ser encontradas em livros de estatística e de ciências afins.¹⁰,³⁰ Desta maneira, para um número limitado de réplicas, o IC passa a ser expresso como:

(8) $$\text{IC:}\mu =\bar{\mathrm{x}}\pm \frac{t\mathrm{s}}{\sqrt{\mathrm{N}}}$$

Os extremos do intervalo de confiança são chamados de limites de confiança. A amplitude do intervalo de confiança é variável e depende do quão certo queremos estar de que esse intervalo inclua o valor verdadeiro, de maneira que quanto maior a certeza, mais amplo será o intervalo necessário.¹⁰,³⁰

11. O QUE É VALIDAÇÃO E QUAIS AS PRINCIPAIS FIGURAS DE MÉRITO EM QUÍMICA ANALÍTICA?

A validação de métodos analíticos é o processo de estabelecer evidências que atestem que um método analítico atende aos requisitos para o uso pretendido, assegurando confiabilidade e consistência aos resultados. Em outras palavras, ao validar um método, demonstra-se que esse é adequado para o seu propósito específico, e que é possível ter confiança nos resultados obtidos, o que é fundamental para a tomada de decisões. Dados analíticos não confiáveis podem comprometer conclusões de estudos e conduzir a julgamentos desastrosos e prejuízos financeiros.³²,³³

A validação dos métodos empregados por um laboratório é um pré-requisito para a acreditação, ou seja, o reconhecimento de que ele realiza seu trabalho de acordo com um padrão nacional ou internacionalmente aceito. Orientações sobre a correta operação para validação de métodos laboratoriais são fornecidas por uma série de órgãos consultivos estatutários e internacionais.³⁰

A validação analítica é um procedimento essencial em áreas regulamentadas, como o controle de qualidade das indústrias farmacêutica e alimentícia, em que órgãos reguladores estabelecem critérios específicos, como é o caso da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)³⁴ e do Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO).³⁵ A importância da validação também é demonstrada em termos da confiabilidade de métodos empregados em análises forenses, que podem ter seus resultados apresentados ou contestados enquanto provas criminais.³⁰ A validação se torna necessária, portanto, quando se desenvolve um novo método, ou são efetuadas adaptações em metodologias já validadas, incluindo alteração de matrizes analisadas, alterações instrumentais ou faixa de concentração de analitos. Determinado método é considerado validado se suas características estão de acordo com os pré-requisitos estabelecidos.³²

Nessa avaliação, critérios quantitativos são empregados para determinar se um método instrumental é adequado para resolver um problema analítico. Estes critérios são denominados parâmetros de desempenho, ou figuras de mérito do método. São eles: faixa linear, coeficiente de determinação, limites de detecção e quantificação, exatidão, precisão, sensibilidade, seletividade, e robustez. Outros fatores característicos, como frequência analítica, simplicidade, custo e grau de sustentabilidade também são frequentemente considerados.

A faixa linear é o intervalo que se estende desde o menor nível de concentração de analito no qual resultados com precisão adequada podem ser obtidos (o limite de quantificação do método) até o nível de concentração em que a curva passa a se distanciar do modelo linear.³⁶ A Agência Nacional de Vigilância Sanitária, conforme a RDC No. 166 e o Guia No. 10/2017,³⁷ orienta que a avaliação da linearidade inclua a verificação do comportamento da variância dos resíduos para assegurar a adequação do modelo de calibração. Nesse caso, os dados são considerados homocedásticos quando a variância permanece constante em toda a faixa de concentração, condição que sustenta o uso da regressão linear por mínimos quadrados ordinários. Em contraste, a heterocedasticidade é observada quando a dispersão varia com a concentração, podendo reduzir a capacidade preditiva em níveis mais baixos. Nessas situações, admite-se a aplicação de regressão ponderada, desde que a escolha seja justificada por evidências experimentais, como melhora na distribuição dos resíduos e nos erros.³⁰

A robustez de um método é uma medida da extensão em que suas condições experimentais (por exemplo, pH, temperatura, pureza do reagente, instrumento, operador) podem ser alteradas sem afetar significativamente os resultados que ele fornece. Tal propriedade pode ser estudada de modo simplório, alterando as condições univariadamente, ou seja, de forma independente, ou aplicando planejamento experimental para tratar a codependência dos fatores. Assim, revelam-se quais fatores requerem controle mais rigoroso e quais são de menor significância, sendo possível estimar os intervalos nos quais cada fator pode ser variado sem alterar a qualidade dos resultados.³⁰ Os demais parâmetros de mérito serão discutidos nas sessões posteriores deste trabalho.

Por fim, vale ressaltar que a validação de um método analítico depende das diretrizes seguidas, bem como do tipo de amostra analisada, refletindo a natureza contextual e regulatória desse processo. Como já mencionado, organismos reguladores e normativos, como a ANVISA e o INMETRO, possuem guias próprios, desenvolvidos para atender a diferentes áreas de aplicação. Embora compartilhem fundamentos comuns, as diretrizes destes órgãos refletem finalidades institucionais distintas, o que justifica diferenças na forma de aplicação da validação.

Em termos de parâmetros, há convergência conceitual entre as duas diretrizes. Tanto o INMETRO quanto a ANVISA contemplam avaliação de seletividade, linearidade, exatidão, precisão, robustez e limites de detecção e quantificação. Contudo, a ANVISA detalha de forma mais prescritiva como esses parâmetros devem ser demonstrados, definindo critérios de aceitação e exigindo estudos específicos, como avaliação de efeitos de matriz. O INMETRO, por sua vez, concede maior flexibilidade técnica, permitindo que o laboratório justifique a escolha dos parâmetros e critérios de aceitação com base no uso pretendido do método, desde que demonstre controle metrológico adequado.³⁵,³⁷

12. QUAL A DIFERENÇA ENTRE REPETIBILIDADE E REPRODUTIBILIDADE?

A precisão de um método analítico é frequentemente avaliada em termos de sua repetibilidade e reprodutibilidade, já que estes são conceitos relacionados à consistência e confiabilidade de medições.³⁰,³⁸ Ambos os parâmetros costumam ser expressos em termos de desvio padrão relativo, em unidades percentuais, mas se diferenciam significativamente.

A repetibilidade corresponde à dispersão dos resultados obtidos sob as mesmas condições. Outras abordagens sugerem tratar-se da concordância entre resultados obtidos dentro de um curto período de tempo, pelo mesmo analista, mesmo método, reagentes, condições ambientais e instrumentação.³²,³⁹

A reprodutibilidade equivale à dispersão dos resultados obtidos por um mesmo método, porém sob condições diferentes. Também pode ser vista como a capacidade de um método de produzir resultados consistentes, quando obtidos em dias diferentes, por analistas, equipamentos, ou condições distintas.⁴⁰

Alguns autores sugerem ainda a importância de comparar os resultados oriundos das quantificações de amostras análogas, porém não idênticas, para avaliar a reprodutibilidade de um método. Amostras de solos e plasma sanguíneo são bons exemplos de matrizes que apresentam ampla variação em suas propriedades. A composição química, o tamanho e a distribuição das partículas podem variar substancialmente no caso de amostras de solos, enquanto, em estudos com plasma sanguíneo, variações no teor e composição de proteínas, viscosidade e coloração são inevitáveis. Portanto, os efeitos que tais variáveis exercem sobre o método em análise devem ser considerados em sua reprodutibilidade.³⁰

Tendo em vista que a repetibilidade é um parâmetro avaliado sob condições idênticas, enquanto a reprodutibilidade é avaliada sob condições apenas semelhantes, é esperado que a primeira apresente menor variabilidade. Assim, é recomendado que o parâmetro reprodutibilidade seja aquele empregado em considerações acerca dos parâmetros analíticos de desempenho de um método analítico.³⁰

Por fim, vale ressaltar que, no Brasil, a ANVISA estabelece que o valor máximo de desvio padrão relativo dos resultados, aceitável para que um método seja considerado preciso, é de 5%. A Agência afirma ainda que este parâmetro deve ser associado à metodologia empregada, nível de concentração do analito na amostra e tipo de matriz analisada.³⁷,³⁹ De fato, a equação de Horwitz estabelece que, quanto menor o nível de concentração de um analito, maior o desvio padrão relativo (RSD) associado aos resultados. Em outras palavras, a função de Horwitz mostra que a precisão de um método analítico diminui à medida que o nível de concentração de analito diminui.⁴¹

13. QUAL A DIFERENÇA ENTRE VERACIDADE, PRECISÃO E EXATIDÃO (ACURÁCIA)?

A veracidade de um método analítico se refere à sua capacidade de fornecer resultados confiáveis, isto é, que se aproximam do valor verdadeiro e que sejam consistentes quando o método é repetido. Um alto nível de veracidade é equivalente à ausência de vieses no método.³⁰ Como já mencionado, a validação dos métodos analíticos é um processo essencial para garantir essa veracidade, demonstrando que o método é adequado para solucionar o problema analítico pretendido.

A exatidão é um parâmetro de mérito que se refere à capacidade do método analítico de fornecer resultados próximos ao valor verdadeiro. Em outros termos, a exatidão é a concordância entre o valor real da quantificação do analito na amostra analisada e o estimado pelo processo analítico.³⁰,³⁹

Esse parâmetro pode ser avaliado perante três abordagens distintas: (i) análise de materiais de referência certificados (certified reference materials, CRM), os quais serão melhor detalhados na questão 14. Essa é a abordagem mais recomendada para avaliar a exatidão de um método, porém, os CRM são altamente custosos e a abrangência reduzida de matrizes e analitos limita seu uso. (ii) Testes de adição e recuperação de analito, em que são comparados os resultados reais da quantificação de uma amostra fortificada (em que foram adicionadas concentrações conhecidas do analito, em diferentes níveis) com os resultados previstos conforme a fortificação. Caso a recuperação não seja próxima de 100%, um viés no método é evidenciado. (iii) Comparação dos resultados das quantificações com os fornecidos por outros métodos já pré-estabelecidos e consolidados. Esta última abordagem é, na prática, a mais utilizada no desenvolvimento de novos métodos.⁴²-⁴⁴

A exatidão também pode ser estabelecida mediante estudos colaborativos interlaboratoriais. Tais estudos implicam na aceitação de, no mínimo, cinco grupos participantes. A principal dificuldade encontrada nesse caso envolve a garantia de estabilidade do analito, isto é, assegurar que a concentração do analito a ser determinada na amostra permaneça idêntica durante todo o decorrer do estudo.⁴²-⁴⁴

Nos casos comparativos mencionados, a exatidão é garantida por meio da manutenção da hipótese nula entre resultados, avaliada, por sua vez, por teste t pareado de comparação entre médias, conforme esclarecido na questão 20. Por fim, a precisão é o grau de proximidade entre resultados replicados, fornecendo uma medida do erro indeterminado associado ao método em questão. Nesse âmbito, a precisão é frequentemente expressa em termos de desvio padrão relativo e considerada em termos de repetibilidade ou reprodutibilidade, como melhor esclarecido na questão 12.

14. O QUE É UM CRM E PARA QUE É UTILIZADO?

Materiais de referência certificados (certified reference materials, CRM) são amostras produzidas, com propriedades físicas definidas, que simulam ao máximo uma determinada amostra real e contêm concentrações conhecidas dos analitos. Tais materiais de controle são rigorosamente preparados e quantificados, de acordo com metodologias bem estabelecidas, previamente validadas e mundialmente reconhecidas.⁴⁴

Naturalmente, este material deve ser suficientemente homogêneo e estável com respeito às propriedades especificadas, de modo a ser adequado para o seu uso pretendido em um processo de medição. O principal objetivo de seu uso é assegurar confiabilidade metrológica à validação de novos métodos de medição e, portanto, garantir a qualidade dos resultados.³⁵,³⁹

Diferentes empresas, acreditadas por órgãos reguladores, produzem e comercializam esses materiais. Os produtos são, portanto, disponibilizados ao mercado acompanhados de certificados que os detalham, a incerteza associada às propriedades desejadas, bem como a rastreabilidade metrológica. No Brasil, o INMETRO³⁵ e o Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT)⁴⁵ são os principais órgãos responsáveis pela produção e certificação de CRM.

Como já mencionado, o processo de avaliação da exatidão de um método analítico por meio de CRM é a abordagem mais recomendada para determinar este parâmetro analítico. O procedimento consiste, então, em analisar um número suficiente de réplicas desse material, e comparar estatisticamente os resultados obtidos nas quantificações com o valor certificado, fornecido pelo fabricante. Neste caso, um teste t pareado entre médias, se as variâncias forem homogêneas, pode atestar a manutenção ou não da hipótese nula conforme esclarecido na questão 20.³⁰

Na utilização de um CRM para avaliar a exatidão de um método analítico, uma limitação frequentemente encontrada é o uso de um material que não corresponde à matriz analisada ou mesmo o não uso de um CRM quando esse está disponível. Além disso, é importante atentar-se para a completa descrição dos CRMs utilizados, incluindo informações como tipo (nome), fabricante, número de referência ou do catálogo e lotes. Também é recomendado reportar a concentração certificada do analito, além da concentração determinada, já que os mesmos materiais podem apresentar concentrações distintas dependendo da data de fabricação.⁴⁶

Contudo, apesar do uso de CRMs ser recomendado como parte importante da verificação da exatidão de um método analítico, é preciso considerar que esses materiais apresentam elevado custo e que a indisponibilidade de variedade de matrizes e analitos dificulta suas aplicações.³²

15. O QUE É ADIÇÃO E RECUPERAÇÃO?

Ensaios de adição e recuperação de analito são uma estratégia alternativa para avaliar a exatidão de um método analítico, especialmente quando materiais de referência certificados e métodos primários de análise não estão disponíveis e ensaios interlaboratoriais são inviáveis.

Como o próprio nome sugere, nessa estratégia o analito (espécie a ser determinada) é adicionado a porções da amostra em quantidades conhecidas e que resultem em concentrações que estejam dentro dos limites de concentração da curva analítica de calibração. As amostras resultantes são chamadas de amostras fortificadas ou enriquecidas, enquanto o analito adicionado é chamado de spike. Recomenda-se que as adições sejam realizadas em três concentrações distintas (baixa, média e alta) e que cubram toda a faixa de trabalho da curva analítica.

Após a fortificação, as amostras fortificadas e não fortificadas são submetidas às mesmas etapas analíticas e as concentrações estimadas são empregadas no cálculo da recuperação, por meio da comparação da concentração do analito na amostra fortificada com a esperada, avaliando-se a capacidade do método de “recuperar” quantitativamente o analito.⁴⁷ Assim, a recuperação (R) pode ser calculada como o percentual de recuperação do analito e pode ser expressa como:

(9) $$R=\frac{(C_f-C_{nf})}{C_{ad}}\times 100$$

onde C_f é a concentração do analito na amostra fortificada; C_nf é a concentração do analito na amostra não fortificada e C_ad é a concentração do analito adicionado na amostra fortificada.

As faixas de recuperação adequadas e aceitáveis normalmente estão relacionadas aos níveis de concentração determinados, de maneira que quanto menor a concentração, maiores são os intervalos de recuperação aceitos, devido à maior incerteza associada à determinação de concentrações menores. De acordo com a Association of Official Analytical Collaboration International (AOAC),⁴⁷ valores de recuperação entre 80-110% são considerados adequados para analitos presentes em concentrações próximas a 1 mg kg^-1, enquanto para níveis de 1 µg kg^-1 são aceitas faixas mais amplas, entre 40-120%. Ressalta-se, contudo, que os critérios de aceitação devem seguir as normativas e legislações vigentes aplicáveis a cada laboratório e tipo de análise.

Uma das limitações dos ensaios de adição e de recuperação de analito para a avaliação da exatidão de um método é que o analito adicionado à amostra, provavelmente, não interagirá com os componentes da amostra da mesma maneira que o analito já naturalmente presente na matriz, o que se torna particularmente crítico em análise de especiação, nas quais diferentes espécies químicas de um mesmo elemento podem apresentar comportamentos físico-químicos distintos. Além disso, nessa estratégia, é necessário garantir que o analito adicionado esteja homogeneamente distribuído na matriz da amostra e que os processos de extração e de detecção empregados tenham eficiências equivalentes tanto para o analito nativo quanto para o analito fortificado.⁴⁷,⁴⁸

16. QUAL A DIFERENÇA ENTRE LOD INSTRUMENTAL E LOD DO MÉTODO ANALÍTICO?

Inicialmente, é importante conceituar o que é limite de detecção (limit of detection, LOD) de maneira geral. A definição mais objetiva é que o limite de detecção é a menor concentração de um analito que pode ser detectada com um determinado nível de confiança.²¹ Devido à maior incerteza do sinal analítico medido quando a concentração que representa o LOD é utilizada, a quantificação do analito com precisão não é possível. Uma outra definição do limite de detecção é a concentração do analito que produz um sinal analítico de magnitude três vezes maior que o ruído instrumental ou que o sinal analítico do branco. Muitas vezes negligenciado, o ruído (ou sinal analítico do branco), possui grande importância para o cálculo dos LODs. Imagine que você esteja num estádio de futebol e precise falar algo com uma pessoa que está ao seu lado a uma distância fixa. Para que ela te ouça com o mínimo de clareza, você precisará falar em uma intensidade vocal três vezes maior do que o barulho do ambiente em que se encontra. Imagine duas situações: um estádio lotado em uma final de campeonato e um estádio vazio, onde apenas vocês estão presentes. No primeiro caso, a intensidade necessária para que sua voz seja detectada pela pessoa é muito maior do que no segundo, já que os ruídos presentes em ambos os casos são muito diferentes. Trazendo esse exemplo para o universo de química analítica, medidas que possuem ruídos significativos ou grandes variações nas medidas do branco, fornecem LODs maiores do que aqueles em que o ruído é pequeno e a variação nas medidas do branco é baixa.

Esse conceito de limite de detecção é aplicado diretamente a qualquer tipo de técnica analítica instrumental. O LOD pode ser obtido de algumas maneiras, sendo a escolha adequada em função do tipo de técnica analítica instrumental. A primeira possibilidade é a partir da construção de uma curva analítica de calibração e obtenção dos parâmetros da equação da reta. Em posse do coeficiente angular (a) e do desvio padrão de medidas do sinal analítico do branco (sd _branco), utiliza-se a fórmula abaixo para calcular o LOD.

(10) $$\mathrm{LOD}=\frac{3\times {\mathrm{sd}}_{\text{branco}}}{\mathrm{a}}$$

Alternativamente, o desvio padrão do sinal analítico do branco - que é obtido a partir de medidas instrumentais de soluções “branco” (instrumental) ou do “branco” do procedimento analítico (método) - pode ser substituído pelo desvio padrão do intercepto obtido no método de regressão linear. A segunda possibilidade para obtenção do LOD é de maneira experimental. Aqui, mede-se o sinal analítico em função da variação da concentração do analito até que ele atinja o valor de três vezes o ruído (ou desvio padrão do sinal do branco). Quando esse valor de sinal é atingido, a concentração responsável é definida como limite de detecção.

Independentemente do método escolhido, o limite de detecção obtido é definido como LOD instrumental da técnica analítica em uso e é bastante utilizado para comparar a detectabilidade entre diferentes técnicas analíticas. Frequentemente são apresentadas tabelas em livros didáticos comparando diferentes tipos de detectores que são acoplados a técnicas de separação, como cromatografia líquida de alta eficiência (high-performance liquid chromatography, HPLC), cromatografia gasosa (gas chromatography, GC) e eletroforese capilar (capillary electrophoresis, CE). Por outro lado, o limite de detecção do método analítico é a concentração referente ao LOD obtida pela aplicação do método analítico desenvolvido e validado. Em muitos casos, o limite de detecção instrumental e do método analítico são equivalentes, como, por exemplo, um método que permite a análise direta da amostra. Porém, é importante lembrar que um método analítico é composto por diversas etapas, tais como preparo e pré-tratamento de amostra, e não apenas a medida instrumental. Portanto, se determinadas etapas de preparo de amostra forem adicionadas ao método, os valores de LOD podem não ser os mesmos. Cabe ressaltar aqui que os “brancos” utilizados nos cálculos também resultam em diferenças nos valores de LOD. Para o LOD instrumental, utilizam-se medidas do branco da curva de calibração, ou seja, uma solução que não contém o analito. Já para o LOD do método, a amostra “branco” (sem o analito) é submetida ao processo analítico e, portanto, suscetível às incertezas do procedimento. Esse fato frequentemente resulta em valores superestimados de LODs instrumentais quando comparados com os do método.

Considere um método analítico em que uma etapa de diluição de 10 vezes é necessária antes da medida instrumental. Nesse caso, o LOD obtido pela técnica instrumental não será o mesmo do método analítico desenvolvido, visto que a concentração “original” da amostra é 10 vezes maior do que a medida pelo instrumento. De maneira similar, métodos que possuem etapas de pré-concentração, extração, diluição ou outro tipo de tratamento de amostra podem fornecer valores de LOD maiores ou menores quando comparados com o limite de detecção instrumental. Essa é uma informação valiosa, visto que o método analítico utilizado pode produzir LODs superiores aos obtidos pela técnica analítica em uso. Por isso, não se atenha aos limites de detecção instrumentais que são comumente relacionados às técnicas analíticas instrumentais. Com o uso de uma boa técnica de preparo de amostra, é possível atingir LODs ainda menores. Por fim, essa discussão apresentada aqui também pode ser aplicada a outras importantes figuras de mérito da validação, como faixa linear e limite de quantificação.

17. QUAL A DIFERENÇA ENTRE SENSIBILIDADE E DETECTABILIDADE?

Os termos sensibilidade e detectabilidade são parâmetros de desempenho de um método analítico e são frequentemente confundidos e, por isso, merecem ser conceituados com atenção. Sensibilidade é a variação da resposta instrumental em função da variação na concentração do analito.²¹ Ela é representada pelo coeficiente angular (slope) da curva analítica do método. Um método com maior sensibilidade significa que a variação da resposta instrumental é maior em relação à mesma mudança na concentração do analito. Por um lado, um método de alta sensibilidade pode, potencialmente, resultar em menor limite de detecção. Por outro lado, esse método pode estar sujeito a menor precisão, visto que a resposta instrumental pode ser afetada por pequenas mudanças nas condições de aplicação do método.

Um outro conceito relacionado ao desempenho de um método analítico é a sua capacidade de distinguir um sinal instrumental relacionado à presença do analito do ruído ou sinal de fundo. O termo detectabilidade se aplica, de maneira geral, à menor concentração do analito que o método é capaz de detectar e é utilizado para comparar o desempenho de diferentes métodos. Por exemplo, é comum a expressão “o método A possui detectabilidade maior do que o método B, para o mesmo analito”. Isso significa que o método A é capaz de detectar concentrações menores do analito quando comparado com o método B. O conceito de detectabilidade está fortemente relacionado com o de limite de detecção, que é a menor concentração de um analito que pode ser detectada com um determinado nível de confiança, conforme já foi explorado na questão 16. Portanto, maior sensibilidade não implica, obrigatoriamente, maior detectabilidade. Um método A pode ser altamente sensível (elevada inclinação da curva), mas a distinção do sinal do branco pode ser prejudicada por diversos fatores inerentes ao processo analítico, tornando o analito menos detectável. Por outro lado, um método B pode ser menos sensível (inclinação da curva menos pronunciada), mas com o sinal analítico sendo distinguível do branco com valores menores, tornando a detectabilidade maior.

18. QUAL A DIFERENÇA ENTRE SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE?

Segundo algumas definições gerais encontradas em dicionários, seletividade remete a palavras-chave como “opção”, “seleção”, “requisitos” e “preferência”. Já especificidade se relaciona principalmente a palavras como “particular”, “peculiar”, “distinto” e “exclusivo”. Mas como será que essas definições se encaixam nos conceitos de Química Analítica? Para entender melhor essa questão, precisamos recorrer a guias ou diretrizes, que nada mais são do que procedimentos padronizados, boas práticas e requisitos específicos, elaborados por órgãos como o International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH),⁴⁹ que foca principalmente na qualidade, segurança e eficácia de medicamentos; a Eurachem,⁵⁰ que atua na qualidade de medições químicas, seja pela validação de métodos, garantia da qualidade, rastreabilidade metrológica e interpretação de resultados analíticos; a IUPAC,⁵¹ uma autoridade mundial na padronização da nomenclatura química, terminologia, símbolos e métodos de medição na área de Química; e AOAC,⁵² uma organização internacional que desenvolve, valida e publica métodos analíticos oficiais.

Seletividade e especificidade são conceitos que costumam ser confundidos na validação de métodos analíticos, ou seja, no processo em que se demonstra que um procedimento analítico atende ao seu propósito e se avalia seu desempenho em relação a figuras de mérito, como exatidão, precisão, linearidade, robustez, entre outras. Segundo a diretriz The Fitness for Purpose of Analytical Methods - A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics⁴⁸ da Eurachem, a seletividade é a capacidade do método de determinar analitos específicos em misturas ou matrizes sem interferências de outros componentes de comportamento semelhante. Ela é avaliada testando-se o método em amostras com interferentes conhecidos ou comparando os resultados com outros métodos independentes, quando a presença dessas interferências é incerta. Já a diretriz ICH Q2(R2)⁵³ para validação de procedimentos analíticos trata ambos os conceitos de forma conjunta. Nesse caso, especificidade/seletividade referem-se ao grau em que outras substâncias interferem na determinação de um analito usando um procedimento analítico específico. A especificidade costuma indicar a capacidade de identificar inequivocamente o analito de interesse, enquanto a seletividade é um conceito relativo que descreve o quanto um analito pode ser medido em misturas ou matrizes complexas sem interferências de outros componentes com propriedades semelhantes.

Uma analogia interessante a respeito desses conceitos foi elaborada por Roy.⁵⁴ Imagine que você tenha um cadeado e um molho de chaves, onde apenas uma delas é capaz de abri-lo. Se houver um método capaz de identificar a chave correta apesar de haver outras tantas, então esse método é dito específico para essa chave. Note que, para a especificidade, a identificação de quais outras chaves compõem o molho não é necessária. Por outro lado, suponha que você conheça quais são as cores, tamanhos e fabricantes das chaves que compõem o molho. Se é necessário ao método conhecer todas as chaves do molho para identificar a correta, diz-se que ele é seletivo. Nesse ponto, é importante frisar que um cadeado que é aberto por diferentes chaves não seria nem específico e nem seletivo à chave correta. Trazendo para o universo analítico, a abertura do cadeado é a resolução de um problema analítico, no qual o analito é a chave correta e os potenciais interferentes são as outras chaves que compõem o molho, no caso, a matriz da amostra. Um método analítico específico é capaz de identificar exclusivamente um analito numa amostra com demais componentes, já o método seletivo é capaz de identificar esse mesmo analito mesmo sabendo quais os outros componentes presentes podem prejudicar a execução dessa tarefa. Dessa forma, a especificidade se relaciona a apenas um analito, enquanto a seletividade é correlata à resposta de um método a diferentes analitos presentes na amostra.

19. QUAL A DIFERENÇA ENTRE RUÍDO E SINAL DE FUNDO?

Métodos instrumentais de análise química são aqueles que empregam instrumentos para medir propriedades físico-químicas de uma determinada amostra, objetivando identificar e quantificar alguns de seus constituintes de interesse. Quando realizamos uma medição, dois componentes são levados em consideração: o sinal analítico - a parte determinada e que contém informações relevantes, e o ruído - que são contribuições aleatórias devido a flutuações indesejadas no sinal, as quais podem comprometer a exatidão e precisão das medidas. É importante enfatizar que medidas livres de ruído são inalcançáveis em um laboratório, uma vez que estão sujeitas a efeitos termodinâmicos e quânticos impossíveis de se evitar.²¹ Dessa forma, o analista deve direcionar seus esforços para maximizar o valor de sinal enquanto minimiza o ruído.

Na maioria dos casos, a magnitude do ruído é constante e independente do sinal, o que faz com que sinais menos intensos sejam mais impactados pelo ruído. Nesse sentido, o emprego da relação sinal/ruído (signal-to-noise ratio, SNR) torna-se fundamental para avaliar o desempenho de métodos analíticos e instrumentos. Realizando-se medidas para uma solução analítica, o sinal (S) pode ser associado ao valor medido para o analito, e o ruído (R), à variação de sucessivas medidas sob uma mesma condição. Nesse caso, podemos associá-los, respectivamente, aos valores de média ($\bar{\mathrm{x}}$) e desvio padrão (sd) da medida.⁵⁵

(11) $$\mathrm{SNR}=\frac{\bar{\mathrm{x}}}{\mathrm{sd}}$$

Uma vez que o desvio padrão relativo (RSD) é definido pela razão inversa, então:

(12) $$\mathrm{RSD}=\frac{\mathrm{sd}}{\bar{\mathrm{x}}}$$

(13) $$\mathrm{SNR}=\frac{1}{\mathrm{RSD}}$$

Em geral, medidas com confiabilidade são obtidas quando SNR ≥ 3, e a capacidade de detecção de sinais é obtida quando 2 ≥ SNR ≥ 3.¹¹ As medidas instrumentais podem apresentar diversos tipos de ruído, que podem ser majoritariamente divididos em ruído químico e ruído instrumental.

O ruído químico é causado por diversas variáveis incontroláveis, como variações de temperatura, pressão, umidade, intensidade luminosa e outras. Já o ruído instrumental apresenta maior complexidade, podendo ser dos tipos térmico, shot, flicker (ou 1/f) e ambiental. O ruído térmico é originário da agitação térmica de elétrons em componentes eletrônicos (resistores, capacitores e transdutores) do instrumento, resultando em flutuações na voltagem. Como o ruído produzido é proporcional à temperatura, muitos instrumentos modernos costumam ter sistemas de refrigeração para detectores e outros componentes eletrônicos. Por ser independente da frequência, muitas vezes é chamado de ruído branco, por analogia com a luz branca, que apresenta todas as frequências. O ruído do tipo shot ocorre sempre que elétrons ou outras partículas carregadas atravessam uma junção, por exemplo, o movimento entre duas superfícies de carga oposta ou em interfaces pn encontradas em fotocélulas. Esses eventos são aleatórios e quantizados, ocorrendo sob uma gama de frequências, como o ruído térmico. O ruído flicker apresenta magnitude inversamente proporcional à frequência e, por isso, é muitas vezes denominado ruído 1/f. De origem ainda não completamente compreendida, o ruído flicker é mais relevante em baixas frequências, onde aparece como um desvio de longo prazo no sinal analítico. Por fim, o ruído ambiental ocorre pela captação de frequências externas e condições externas ao instrumento. Considerados antenas em potencial, os materiais condutores são capazes de captar radiação de alta frequência como ondas de TV, celular, rádio e linhas de energia, convertendo-as em sinais elétricos. Outras contribuições em potencial, mas com baixa frequência, são as mudanças de temperatura durante o dia ou ao longo do ano.

Para se obter resultados mais confiáveis, é essencial que a contribuição do ruído seja considerada. De maneira prática, boa parte dos analistas utiliza estratégias como o desconto do branco analítico (solução que idealmente contém todos os componentes da amostra, exceto o analito), o emprego do valor médio de sucessivas medidas para a mesma amostra (para suavizar flutuações aleatórias), o ajuste da linha de base (zeragem do instrumento), o ajuste de condições instrumentais (largura de banda e tempo de integração do sinal, por exemplo), o uso de algoritmos matemáticos para a filtragem e alisamento de sinais (para mitigar a contribuição do ruído) e o controle do ambiente de operação do instrumento (temperatura, vibrações e estrutura da rede elétrica). Outras formas de atenuar o ruído instrumental e incrementar a qualidade dos resultados analíticos podem ser encontradas em livros de análise química instrumental.²¹,⁵⁵

Assim como o ruído, o sinal de fundo (background, BG) é o sinal medido por um instrumento analítico que é gerado por outras fontes que não o analito, podendo ser de componentes da matriz, de interferências físicas ou químicas, do próprio instrumento e do ambiente. Nesse ponto, é importante diferenciar ruído de sinal de fundo. O BG apresenta um sinal constante ou previsível, ao contrário do ruído que é aleatório e imprevisível. Segundo Amais et al.,⁵⁶ é incorreto afirmar que o ruído é o sinal de fundo ou apenas flutuação da linha de base sem a presença do analito, uma vez que o ruído afeta ambos, o sinal analítico e o BG. Tomemos como exemplo uma determinação espectrofotométrica. Ao realizarmos uma medida sem a cubeta no porta-amostra, qualquer contribuição ao sinal é proveniente de flutuações aleatórias do equipamento ou do ambiente, dessa forma, estaríamos considerando o ruído da medição. Quando inserimos o branco para realizar a zeragem ou obtenção da linha de base, as contribuições constantes devido à cubeta, ao solvente, às partículas em suspensão entre outros, passam a ser consideradas, sendo este o sinal de fundo. Note que nesse último caso, as medidas também estão sujeitas a flutuações instrumentais/ambientais, ou seja, o BG também é afetado pelo ruído. Uma discussão mais aprofundada sobre fontes de BG e alternativas para superá-lo ou corrigi-lo em diferentes técnicas de análise espectrométrica, eletroanalítica e de separação pode ser encontrada no manuscrito de Amais et al.⁵⁶

20. QUAL TIPO DE TESTE t DEVO APLICAR NA AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA DOS MEUS DADOS?

Em Química Analítica, é bastante comum se deparar com a necessidade de comparar os resultados obtidos pelo método desenvolvido, seja com um valor de referência, por meio da análise de um CRM, seja com um método oficial ou técnica analítica alternativa. Embora os valores médios obtidos possam ser comparados por simples inspeção ou aferição dos erros absolutos e relativos, trata-se de abordagens limitadas do ponto de vista estatístico. Nesse sentido, o analista pode empregar testes de significância para inferir se a diferença entre dois valores obtidos é significativa ou meramente associada a erros aleatórios. A literatura destaca uma gama de testes para esse propósito, sejam eles paramétricos como testes t de Student e análise de variância (analysis of variance, ANOVA), ou não paramétricos, como os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Wilcoxon e Friedman.⁵⁷

Um dos mais utilizados em Química Analítica é o teste t de Student, um teste de hipótese onde assume-se que as observações apresentam uma distribuição normal, que contempla a hipótese nula (H₀) onde as diferenças entre os valores não possuem erros sistemáticos e são meramente aleatórias, e a hipótese alternativa (H₁) que admite o contrário. O teste de hipótese ocorre após a comparação do valor em módulo de t_calculado com valores de t_crítico tabelados, para um dado nível de significância e graus de liberdade. Se t_calculado < t_crítico, não há evidências para que H₀ seja rejeitada e, caso t_calculado > t_crítico, rejeita-se H₀ e considera-se as diferenças estatisticamente significativas. O nível de significância (α) descreve a probabilidade de se rejeitar a hipótese nula. O valor mais empregado é de 0,05, o que denota uma chance de 5% de se cometer um erro do tipo I, concluindo que existe uma diferença significativa quando não há, ou ainda, que há um nível de 95% de confiança de que a conclusão foi correta.⁵⁸ No contexto de análises químicas, o teste t pode ser empregado sob diferentes aspectos, sendo comumente classificado como pareado e não pareado. No entanto, uma abordagem mais simples seria relacionar o teste à característica dos resultados obtidos e ao propósito da comparação. Nesse ponto, uma dúvida comum pode surgir: Qual tipo de teste t devo usar?

O teste t de amostra única pode ser aplicado para comparar a média amostral ($\bar{\mathrm{x}}$) com o valor tido como verdadeiro (µ) da qual a amostra foi retirada, que, no caso, pode ser um valor certificado. O valor de t, em módulo, pode ser calculado pela Equação 14.⁵⁹

(14) $$t_{\text{calculado}}=(\bar{\mathrm{x}}-\mu )\frac{\sqrt{\mathrm{n}}}{{\mathrm{s}}_{\mathrm{d}}}$$

Tomemos como exemplo a análise de um material de referência certificado 1515 Apple Leaves, do National Institute of Standards and Technology (NIST), com valor certificado de fração mássica para Ca de 15250 ± 100 mg kg^-1. Uma análise com quintuplicatas autênticas (n = 5) desse CRM levou a resultados de 17100, 14980, 15720, 16020 e 15300 mg kg^-1, obtendo-se o valor médio = 15824 mg kg^-1 e um desvio padrão s_d = 816 mg kg^-1. Para esse exemplo, o valor de t_calculado (em módulo) seria 1,57 e o valor de t_crítico obtido em tabela para 95% de confiança e 4 graus de liberdade (n - 1) seria de 2,78. Uma vez que t_calculado < t_crítico, pode-se inferir que o valor de referência e o valor obtido em análise não apresentam diferenças estatísticas nessas condições. É importante enfatizar que essa abordagem não leva em consideração a incerteza do CRM, sendo que, nesse caso, o fabricante expressa como incerteza expandida (U_95%(x)) e não como o desvio padrão.

Em um laboratório analítico, é corriqueiro realizar a comparação de resultados, seja com um método oficial ou com uma técnica analítica alternativa. Nesse caso, uma mesma amostra é analisada por duas metodologias diferentes e deve-se garantir que as variâncias sejam iguais. O teste F de hipótese por razão de variâncias pode ser empregado para esse propósito:

(15) $$F_{\exp }=\frac{{\mathrm{s}}_1^2}{{\mathrm{s}}_2^2}$$

onde s₁ e s₂ são desvios-padrão para as medidas realizadas pelos métodos 1 e 2, respectivamente.¹¹ O valor de F_exp é então comparado com F_crítico (tabelado), para dado número de réplicas e nível significância, sendo que se F_exp < F_crítico, as variâncias podem ser combinadas. Cabe ressaltar que no cálculo do F_exp, a maior variância deve ficar no numerador e a avaliação do valor de F tabelado deve ser feita com atenção.

Os valores de variância agrupada (s²_agr) e t (em módulo) podem ser calculados pelas Equações 16 e 17, respectivamente:

(16) $${\mathrm{s}}_{\mathrm{agr}}^2=\frac{({\mathrm{n}}_1-1)\times {\mathrm{s}}_1^2+({\mathrm{n}}_2-1)\times {\mathrm{s}}_2^2}{({\mathrm{n}}_1+{\mathrm{n}}_2-2)}$$

(17) $$t_{\text{calculado}}=\frac{{\bar{\mathrm{x}}}_1-{\bar{\mathrm{x}}}_2}{\sqrt{{\mathrm{s}}_{\mathrm{agr}}^2(\frac{1}{{\mathrm{n}}_1}+\frac{1}{{\mathrm{n}}_2})}}$$

onde ${\bar{\mathrm{x}}}_1$ e ${\bar{\mathrm{x}}}_2$ são as médias, s₁ e s₂ são os desvios-padrão, e n₁ e n₂ são os números de replicatas para os métodos 1 e 2. O número de graus de liberdade de t é n₁ + n₂ - 2. Como exemplo, suponha que uma amostra de solo decomposta em bloco digestor (n = 3) e em micro-ondas (n = 5) para determinação de Cu por espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente (inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS), gerando os seguintes resultados ($\bar{\mathrm{x}}$ ± s_d) de 3,05 ± 0,15 e 2,92 ± 0,10 μg L^-1, respectivamente. Note que o número de replicatas é diferente, tornando essa estatística não pareável. Nesse exemplo, o teste F mostrou variâncias iguais, o valor de t_calculado seria 1,49 e o valor tabelado de t_crítico para um teste bicaudal, com 6 graus de liberdade e 95% de confiança, é de 2,45. Como o valor calculado (em módulo) é menor do que o tabelado, a hipótese nula é aceita, ou seja, os dois métodos de preparo são estatisticamente semelhantes sob essas condições.

Em outro exemplo, suponha que 5 amostras de diferentes farinhas de trigo tenham sido submetidas a análises por espectrometria de absorção atômica em chama (flame atomic absorption spectrometry, FAAS), o método proposto, e comparadas à espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP OES), o método de referência, para determinação de Fe, sendo o desejo do analista saber se os mesmos são equivalentes. Nesse caso, o teste t pareado é utilizado, pois as medidas são repetidas e as observações correlacionadas.³⁰ Portanto, o valor de t (em módulo), pode ser calculado pela Equação 18:

(18) $$t_{\text{calculado}}=\frac{\bar{\mathrm{d}}\sqrt{\mathrm{n}}}{{\mathrm{s}}_{\mathrm{d}}}$$

onde $\bar{\mathrm{d}}$ é o valor médio das diferenças entre os valores pareados, s_d o desvio padrão dessa média e n o número de valores pareados. Supondo que as amostras (A₁-A₅) apresentaram os seguintes pares de valores de concentração (em mg L^-1) para as diferentes metodologias: 2,63 e 2,22 (A₁), 2,69 e 2,37 (A₂), 2,88 e 2,54 (A₃), 2,51 e 2,28 (A₄) e 2,98 e 2,32 (A₅); então d₁ = +0,41, d₂ = +0,32, d₃ = +0,34, d₄ = +0,23 e d₅ = +0,66; com -d = 0,392 e sd = 0,163. O valor de t_calculado para essa comparação seria de 5,37 e o valor tabelado de t_crítico para 4 graus de liberdade (n - 1) e nível de confiança de 95% seria 2,78. Como t_calculado > t_crítico, a hipótese nula é rejeitada, ou seja, os métodos são estatisticamente diferentes. Discussões mais aprofundadas sobre comparação de resultados e testes estatísticos podem ser encontrados na literatura.³⁰,⁵⁸

CONCLUSÕES

Este trabalho apresenta-se como um instrumento de apoio à formação e à atualização em Química Analítica, ao reunir respostas claras, didáticas e fundamentadas para dúvidas recorrentes que persistem no ensino e na prática profissional. A seleção dos temas, construída a partir da experiência docente dos autores e do diálogo com colegas de diferentes instituições, priorizou conceitos que ainda geram interpretações divergentes, contribuindo para a redução de ambiguidades terminológicas e para a uniformização de fundamentos.

A integração entre Química Analítica clássica e instrumental, aliada a princípios de Estatística e Metrologia, favorece uma abordagem crítica, coerente e contextualizada. Reconhece-se, contudo, que o dinamismo da área continuamente impõe o surgimento de novas demandas conceituais, impulsionadas por avanços tecnológicos, regulatórios e pela incorporação de temas emergentes, como miniaturização, sustentabilidade, nanotecnologia e ferramentas computacionais. Assim, espera-se que esta iniciativa estimule a busca permanente por fontes confiáveis, bem como a ampliação e atualização contínua deste material, fortalecendo a base conceitual necessária à evolução da Química Analítica.

AGRADECIMENTOS

A. Virgilio dedica esse trabalho à memória de Marli S. Virgilio e agradece ao Laboratório de Radioisótopos (CENA/USP) pelo apoio na publicação.

DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS

Todos os dados estão disponíveis no texto.

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Editado por

• Editor Associado responsável pelo artigo:
  Eduardo M. Richter

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Abr 2026
• Data do Fascículo
  2026

Histórico

• Recebido
  18 Dez 2025
• Aceito
  27 Fev 2026
• Publicado
  23 Mar 2026