CARACTERIZAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES: II - SUSCETIBILIDADE AOS VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZKY E DA FEBRE AFTOSARESUMO
Foi estudada a suscetibilidade aos vírus da doença de Aujeszky (ADV) e da febre aftosa (FMDV) de 10 linhagens celulares, pertencentes a 6 espécies animais. A maioria das linhagens mo trou-se sensível ao ADV, enquanto que para o FMDV algumas linhagens foram sensíveis e outras foram resistentes. A linhagem Vero procedente de dois laboratórios comportou-se diferentemente para ambos os vírus. Obteve-se dois tipos de efeito citopático para o ADV, arredondamento celular e formação de sincícios, relacionado à célula hospedeira.
PALAVRAS-CHAVE:
linhagens celulares; suscetibilidade celular; vírus da doença de Aujeszky; vírus da febre aftosa
ABSTRACT
Ten cell lines belonging to 6 animal species were studied in relation to susceptibility to Aujeszky's disease virus (ADV) and foot-and-mouth disease virus (FMDV). Most of the cell lines were susceptible to ADV while only some ofthem were susceptible to FMDV. Vero cell cultures, obtained from 2 laboratories, showed different susceptibility to FMDV and ADV. Rounded cells or syncytial formation, two types of the cytopathic effect induced by ADV were observed related to cell line.
KEY WORDS:
cell lines; viral susceptibility; Aujeszky's disease virus; foot-and-mouth disease virus
INTRODUÇÃO
Suscetibilidade a virus, um dos parâmetros utilizados para a caracterização das linhagens celulares (HATT, 1975), tem sido direcionada para a obtenção de novos sistemas sensíveis a uma ou diferentes amostras virais (ABUHAB et al., 1980).
Entretanto, SIMONI et al. (1985) constataram suscetibilidades diferentes em linhagens celulares originárias de diferentes animais porém, da mesma espécie e do mesmo tipo de orgão. Diferenças também na suscetibilidade a uma amostra viral foram observadas entre clones celulares, oriundos de população de uma mesma linhagem celular (ABUHAB & KOSEKI, 1972; CLARKE & SPIER, 1980; WITTMANN & RZIHA, 1989). Outros autores verificaram que culturas celulares, originárias de uma linhagem suscetível a uma amostra viral, podem modificar o seu comportamento vírus-célula ao longo do cultivo das mesmas em dois diferentes laboratórios (KUBRUSL Y & KOSEKI, 1981; TAKATA et al., 1994).
Um dos parâmetros de avaliação da suscetibilidade de linhagens celulares é a observação das alterações degenerativas causadas pelos vírus nas células, denominadas de efeito citopático, durante as interações vírus-célula hospedeira (SCHMIDT, 1979; FRESHNEY, 1987)
Assim, o objetivo deste trabalho é pesquisar e caracterizar a suscetibilidadeaos vírus da febre aftosa e da doença de Aujeszky, das 10 linhagens celulares, pertencentes a 6 grupos taxonômicos, empregadas neste Instituto.
MATERIAL E MÉTODOS
Linhagens celulares: As linhagens celulares utilizadas foram: IB-RS-2 clone D-10 ( Instituto Biológico-rim suíno ATCC-CRL 1835 ); PK(l 5) (porcine kidney, Sus scrofa ATCC-CCL 33 ); MDBK ( Madin and Darby Bovine Kidney ATCCCCL 22 ); RK1 3 (Rabbit Kidney - ATCC-CCL 37); Vero (Vero "ATCC''- African green monkey kidney-ATCC-CCL 81 e Vero "IAL"- proveniente da ATCC, porém cultivada durante 20 anos no IAL); E. derm (Equine Dermis, Equus caballus ATCC-CCL 57); BHK-21 clone 13 (Babyhamster kidney ATCC-CCL 10); RC-IAL (rim de coelho-Instituto Adolfo Lutz); V-79 (pulmão de hamster) e GBK (bovine kidney). As linhagens provenie·ntes do American Type Culture Collection (ATCC), assim como as células RC-IAL e Vero-"IAL", provenientes da Seção de Culturas Celulares do Instituto Adolfo Lutz, foram mantidas no Centro de Cultivo Celular do Instituto Biológico. As células GBK e V-79, provenientes respectivamente do Instituto de Ciências Biomédicas e do Instituto de Química, da USP, foram mantidas na Seção de Biologia Celular deste Instituto. Todas as linhagens foram mantidas nas mesmas condições, em Meio Eagle Mínimo (MEM) acrescido de 8% de soro bovino.
Amostras virais: Vírus da doença de Aujeszky (ADV), cepa Nova Prata, gentilmente cedida pelo Instituto Desidério Finamor do Rio Grande do Sul e vírus da febre aftosa (FMDV), cepa "O". Campos, foram adaptados na linhagem celular IB-RS-2 clone D-10, apresentando um título de 106 DICC5 / 0,1 mL e 104,5 DICC5/ 0,1 mL respectivamente.
Inoculação viral: Foram utilizados frascos de 25 cm" de área útil, contendo monoestratos celulares confluentes (um para controle e dois para o ensaio com cada vírus). As células, previamente lavadas com MEM sem soro, foram inoculadas com 0,1 mL da suspensão viral e incubadas por 1 hora a 37ºC. Após este período, foram novamente lavadas e reincubadas em MEM sem soro para observação do efeito citopático (ECP). Em seguida as células foram congeladas, descongeladas e centrifugadas para a realização de novas passagens. Foram feitas 3 passagens para cada vírus em todas as linhagens celulares. As linhagens celulares que se apresentaram suscetívds foram preparadas em lamínulas, infectadas com vírus e coradas com Giemsa.
Avaliação: O grau de suscetibilidade das linhagens celulares foi avaliado pelo ECP da linhagem celular IB-RS-2 clone D-10, 24 e 48 horas, respectivamente, para ADV e FMDV, após a inoculação.
RESULTADOS
Na tabela 1 estão representados ·os graus de suscetibilidade das linhagens celulares ao FMDV e ADV comparados ao da linhagem IB-RS-2 clone D-10. Com relação ao FMDV constatou-se suscetibilidade semelhante para BHK-21 enquanto que as demais, sensíveis, em ordem decrescente foram PK(15) = Vero "IAL" > RK1 13 As linhagens RC-IAL, Vero "ATCC", MDBK, V-79eE. dermnão foram suscetíveis.
O ECP induzido pelo FMDV foi caracterizado por células retraídas com núcleos picnóticos (fig. 1-11C).
Com relação ao ADV constatou-se que as linh_agens PK(15), RK1 3 , BHK-21 e E. derm apresentaram o mesmo grau de suscetibilidade da IB-RS-2 clone D-10. As restantes suscetíveis em ordem decrescente foram RC-IAL = MDBK = Vero "IAL" > GBK> Vero "ATCC". Apenas V-79 não foi suscetível.
O ECP induzido pelo ADV em todas as linhagens celulares, exceto as de origem leporina, foi caracterizado pelo arredondamento e birrefringência das células e posterior formação de grumos (fig. 1-11B). Nas linhagens leporinas o ECP caracterizou-se pela formação de sincícios (fig. 4B). Quando a amostra viral proveniente de passagens nas linhagens leporinas foi inoculada na linhagem IB-RS-2 clone D-10, o ECP foi caracterizado pelo arredondamento das células (fig. lB).
A linhagem celular Vero obtida de dois laboratórios e mantidas nas mesmas condições, apresentou suscetibilidade distinta, a Vero "IAL" foi suscetível ao FMDV enquanto que a Vero "ATCC" não apresentou efeito citopático. A Vero "IAL" foi mais suscetível ao ADV do que a fornecida pelo ATCC.
DISCUSSÃO
A suscetibilidade de linhagens celulares a um determinado vírus não corresponde necessariamente ao que ocorre in vivo. Assim, vírus que são específicos para uma espécie animal, podem se replicar em cultura de células de outras espécies (MUNFORD & SIMONI, 1996)
Linhagens celulares de diferentes espécies podem ser suscetíveis ao FMDV (ABUHAB & KOSEKI, 1972; KUBRUSL Y & KOSEKI, 1981; SIMONI et al., 1985) e ao ADV (WITTMANN & RZIHA, 1989) ou a ambos (KOSEKI et al., 1990). Neste estudo as linhagens deorigem de suíno (PK(15) e IB-RS-2 clone D-10), de símio (Vero "IAL") e de hamster (BHK-21) foram sensíveis aos dois vírus, enquanto que as de bovino (MDBK e GBK), de equino (E. derm) e de leporino (RC-IAL) foram suscetíveis ao ADV, porém, não ao FMDV.
Por outro lado, linhagens celulares da mesma espécie de origem podem ou não ser suscetíveis a um determinado vírus. SIMONI et al. (1985), observaram comportamentos distintos na suscetibilidade ao FMDV em três linhagens celulares obtidas de rim suíno. Comportamento semelhante ocorreu neste trabalho com as células leporinas. A RK1 3 foi suscetível ao FMDV, enquanto que a RC-IAL não apresentou efeito citopático. Além disso, linhagens de mesma espécie de origem, porém, obtidas de tecidos diferentes, também mostraram diferenças na suscetibilidade. Assim, a linhagem BHK-21, obtida de rim de hamster, foi sensível ao FMDV e ao ADV, enquanto que a V-79, obtida de pulmão de hamster, não foi suscetível.
A suscetibilidadetambém pode variar entre clones de uma mesma linhagem celular, como observado por outros autores (CASTRO & PISANI, 1967; ABUHAB & KOSEKI, 1972). Contudo, neste trabalho, o clone D-10 da IB-RS-2 manteve a suscetibilidade observada anteriormente na linhagem IB-RS-2 tanto ao FMDV (CASTRO, 1964; SIMONl et al.,1985) como ao ADV (DELAGNEAU et al., 1975; KOSEKI et al., 1990).
Um aspecto interessante a salientar foi o comportamento distinto das duas culturas celulares da linhagem Vero com relação aos dois vírus estudados. Respostas distintas a uma determinada infecção viral foram também observadas em culturas celulares de BHK-21, quando mantidas em laboratórios diferentes e sujeitas a alterações genéticas e/ou ambientais (CLARKE & SPIER, 1980; KUBRUSL Y & KOSEKI, 1981). Estas variações nas respostas têm uma importância maior no controle de imunobiológicos, na variabilidade de resultados dos testes de potência de vacinas, como verificado em células Vero (TAKATA et al., 1994). Desse modo, mostra-se a necessidade de aprofundamento dos estudos das relações hospedeiro-parasita (vírus-células), principalmente a nível molecular.
Com relação ao ECP, as células infectadas com FMDV apresentaram ECP característico de células retraídas com núcleos picnóticos (SIMONI et al., 1985) assim como, as células infectadas com ADV apresentaram formação de sincícios ou arredondamento celular (SCHROM & BABLANIAN, 1981).
A obtenção de diferentes ECP em linhagens celulares infectadas com os herpesvírus, ADV e Herpes simplex, tem sido descrita por outros autores (TOKUMARU, 1957; GOLAIS et al., 1977; RUYECHAN et al., 1979; SCHROM & BABLANIAN, 1981; WITTMANN & RZIHA, 1989). Estas variações no ECP podem estar relacionadas com o vírus, visto que cepas diferentes têm induzido diferentes ECP (TOKUMARU, 1957; GOLAIS et al., 1977; SCHROM & BABLANIAN, 1981). Contudo, as células hospedeiras podem também estar envolvidas no tipo de ECP. SCHROM & BABLANIAN (1981) relataram que embora o tipo de ECP induzido pelo HSV possa ser determinado pelo genoma viral, a formação de sincícios parece, também, ser uma característica da célula hospedeira. Observações semelhantes já haviam sido feitas por GOLAIS & SABÓ (1976) quando constataram que cepas virulentas e atenuadas de ADV induziam a formação de sincícios na linhagem celular de pulmão de coelho e arredondamento celular na linhagem renal de hamster BHK-21. Verificaram também que o tipo de ECP não dependia da morfologia celular (fibroblastóide ou epitelióide). Neste trabalho, a morfologia também não interferiu na formação de sincícios, pois as células das linhagens RK 13 e RC-IAL são, respectivamente, epitelióide e fibroblástóide. Contudo, ambas as linhagens são de origem leporina como a utilizada porGOLAIS & SABÓ (1976), que também formou sincícios. Neste caso a espécie de origem das células talvez esteja influenciando o tipo de ECP, uma vez que na maioria dos trabalhos as linhagens celulares infectadas com ADV e que apresentam formação de sincícios são de origemleporina(TOKUMARU, 1957; GOLAIS & SABÓ, 1976; GOLAIS et al., 1977).
Provavelmente, as linhagens leporinas estariam permitindo a expressão do gene virai que levaria à formação de sincícios e que isto não estaria ocorrendo em células de outras linhagens.
Segundo MANSERVIGI et al. (1977) a glicoproteína gB do HSV tem papel crítico na promoção da fusão celular com conseqüente formação de sincícios, porém, a gC causa a supressão do efeito que leva à formação de policariocitose. Trabalhos relatam que as glicoproteínas gl e gIII do ADV estão envolvidas neste fenômeno, pois em alguns tipos de células, mutantes deficientes em gl, a formação de sincícios foi significantemente reduzida (ZSAK et al., 1992), ao passo que em mutantes deficientes em gIII ocorreu a formação de sincícios (WATHEN & WATHEN, 1986).
Além disso, RUYECHAN et al. (1979), através de mapeamento genético do HSV, localizaram três locus diferentes que estariam associados ao comportamento de células infectadas na formação de sincícios ou de arredondamento celular. Os autores sugerem que a expressão da mutação nos locus syn l e syn3 parece ser dependente do tipo de célula, pois recombinantes com estas mutações causam formação de sincícios em células Vero mas não em células Hep-2.
Em suma, a importância deste trabalho foi a caracterização da suscetibilidade de linhagens celulares pelo quesito efeito citopático, uma vez que as células podem ter seu comportamento alterado ao longo do cultivo, modificando as relações vírus-célula.
Suscetibilidade de 10 linhagens celulares aos vírus da febre aftosa (FMDV) e da doença de Aujeszky (ADV)
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