OCORRÉNCIA DO PRINCiPIO TÖXICO, PRUNASINA, NAS FOLHAS DE HOLOCALYX GLAZIOVIITAUB.^*

Occurrence of the toxic principle, prunasine, in the leaves of Holocalyx glaziovii Taub^*.

RESUMO

Holocalyx glaziovii Taub., (Leguminosae: Caesalpinoideae), conhecido como "alecrim" , apresenta quadro de fotossensibilizagäo do tipo hepat6geno em bovinos, denominado ' 'peste das queimadas ' '. O presente trabalho procura elucidar oa princfpios qufmicos de suas folhas isentas de HCN que provoquem lesöes hepåticas em cobaias. O residuo de acetato de etila, obtido por fracionamento por partigäo do extrato etan61ico, causou a morte das cobaias em cerca de 90min, na dose de 0,40g/ kg, PO. Igualmente o resfduo butan61ico mostrou-se letal na dose de 0,50g/kg. Macro e microscopicamente, näo foram observadas quaisquer lesöes que comprometam um quadro de fotossensibilizagäo. Por métodos cromatogråficos, foram isolados, dos resfduos butan61ico e de acetato de etila, dois flavon6ides, a kampferitrina e kaempferol-3-glicose-7-ramnosfdeo e um glicosfdeo cianogenético, a prunasina. Somente este ültimo composto mostrou-se letal, em 90min, para cobaias, na dose minima de 0,25g/kg, induzindo-lhes sintomas convulsivos.

PALAVRAS-CHAVE
Holocalyx glaziovii; alecrim; fotossensibilizagäo; flavon6ides glicosfdicos; prunasina.

SUMMARY

Holocalyx glaziovii Taub, Leguminosae Caesalpinoideae, popularly known as ' 'alecrim" presents syndrome of photosensitization type hepatogenous in cattle called ' 'burnt pest' '. The present investigation had a task to reach the toxic chemical compounds of the leaves of this plant, free of HCN that promoved hepatic lesions in guinea pigs.

The residue of ethyl acetate, obtained by fractionization with partition of ethanolic extract, caused the death of the guinea pigs in 1 ,5 h when administered 0,40 g/kg, PO. Similarly, the buthanolic residue caused lethality with a dose of0,50g/ kg. Macro and microscopically, it was not observed any lesions that compromised a syndrome of photosensitization.

In the chemical study of the ethyl acetate residue and butanolic residue, two flavonoid glycosides and one cianogenetic glycosides were isolated by chromatographic methods and identified by spectroscopic data as being kampferitrin, kaempferol3-glucopyranosyl-7-rhamnopyranoside and prunasin, respectively. This only last compound showed lethal in I .Sh for guinea pigs in minimum dose of 0,25g/kg with symptom of convulsion.

KEY-WORDS
Holocalyx glaziovii; "alecrim"; photosensitization; flavonoid glycosides; prunasin.

INTRODUCÄO

A ocorréncia do fenömeno de fotossensibilizagäo em bovinos decorrente da ingestäo de plantas nativas é um dos grandes problemas econömicos na pecuåria nacional. Säo conhecidos poucos agentes qufmicos fotossensibilizantes responsåveis por essa intoxicagäo como hipericina (¹) de Hypericum spp, fagopirina (²) de Fagopyrum spp, psoralenos (5- e 8- metoxipsoraleno, 3 e 4) de Ammi majus, lantadeno (⁵) de Lantana camara, esporidesmina (⁶) de Pithomyces chartarum, isotiocianato de alila (⁷) de Thlapsi arvense, entre outros (³). Todavia, os agentes fotodinåmicos de inümeras plantas conhecidas por produzirem fotossensibilizagäo como Holocalyx glaziovii continuam sendo desconhecidos.

O Holocalyx glaziovii Taub. é considerado por alguns taxonomistas como Holocalyx balansae Mich.. (⁸). Foi estudado inicialmente por ROCHA E SILVA (¹⁰) por apresentar o quadro de fotossensibilizagäo em bovinos e daf o termo "peste das queimadas". A espécie vegetal pertence a familia Leguminosae: Caesalpinoideae, vulgarmente conhecida como "alecrim", "alecrim dos campos", "alecrim das matas" e "alecrim de campinas" (⁵, ¹⁰), é considerada t6xica com ampla distribuigäo geogråfica no Brasil, Argentina e Paraguai (²). É "uma årvore de 8 a 15m de altura, com folhas alternadas, disticas paripenadas com 16 a 27 pares de folioIOS" (⁸), contendo 0,090 a 0, 135% de åcido cianfdrico (⁵), talvez em forma glicosilada, pois sob tratamento com a emulSina houve desprendimento deste gås e forte cheiro de aldefdo benz6ico (⁵, ¹¹).

Em 1940, ROCHA E SILVA (¹⁰) descreveu quadro de fotossensibilizaqäo em bovinos com elevada mortalidade quando os animais recebiam extratos aquosos de brotos de H. glaziovii e expostos a luz solar. O desenvolvimento da doenga iniciava com intenso lacrimejamento e fotofobia; dispnéia grave; hemorragias subcutåneas localizadas em barbelas, orelhas, pålpebras, axilas e virilhas seguida de lesöes necr6ticas; além de lesöes extensas na regiäo mais frågeis da pelo e nas partes claras. Ocorria também na fase terminal, a icterícia com espessamento da bile, degeneração gordurosa do fígado e hemorragia no peritôneo e pericárdio. O animal mantido em quarto sombrio por um mês, apresentou-se normal com ligeiro emagracimento e quando sacrificado não foi observado nenhum quadro da doença. Dessa forma, o autor concluiu que deve haver uma relação da ingestão da planta com exposição solar e o agente fotodinâmico era devido ao HCN contido no vegetal. Este fato, foi contestado pelo trabalho de VAN DEWALT (¹⁸) em experimentos com ovinos através de administração diária em doses subletais, por longo período, de cianeto de pótássio sem provocar efeito de fotossensibilização apesar de receber alimentação verde e estando ao ar livre.

O extrato aquoso concentrado de alecrim quando administrado por via peritoneal em gatos anestesiados provoca uma bradipnéia e hipotensão, sendo uma evolução correspondente a uma intoxicação por HCN (¹⁰). A partir destes dados, diversas pesquisas farmacológicas e fitoquímicas surgiram para determinar outros princípios tóxicos existentes além de HCN na planta, que desencadeiam alterações fisiológicas além de provocar o fenômeno de fotossensibilização em bovinos.

Diversos dados farmacológicos foram obtidos a partir do extrato aquoso das folhas de brotos de H. glaziovii, isento de HCN através do tratamento com HCI 0,1 N a 60.°C por 3 dias seguida de neutralização por NaOH 0,1 N (¹⁴):

• - pressão arterial intracarotidiana de rato: hipotensão rápida e fugaz quando injetado intravenosamente mas não bloqueado pelo tratamento prévio de atropina em ^s altas doses nem pela ação de antihistamínico (¹⁴);

• - segmento do intestino isolado de coelho: relaxamento da musculatura lisa seguido de discreto e progressivo aumento da contração muscular (¹⁴):

• - coração isolado de coelho: inicia-se discretamente com ações cronotrópicas e inotrópicas negativas seguida de açóes igualmente positivas (¹⁴); efeito cumulativo do fitotóxico desenvolvido sobre a força confrátil e propulsiva do órgão (¹⁵);

• - coração in situ do sapo: cloridrato de adrenalina retardou o aparecimento da parada cardíaca mas não impediu sua instalação com o aumento da dose do extrato (¹⁵);

• - coração, fígado e rim in situ no coelho: miocardites inespecíficas com alterações vasculares e lesões das fibras cardíacas; extensa degeneração do fígado provocando necrobiose e alteração da estrutura dos canalículos biliares; rins inalterados (¹²);

• - ratos previamente adrenalectomizados ou no desenvolver da experiência: hipotensão inicial seguida de hipertensão quando administrado endovenosamente; ao contrário, a inoculação com KCN não provoca alteração da mesma; os efeitos farmacodinâmicos são independentes da participação da camada medular das adrenais (¹⁶);

• - efeito cumulativo do fitotóxico em cobaias: hipocolesterolemia considerável ao nível sorológico mostrando disfunção hepática relacionada com metabolismo lipídico (¹⁷).

Os experimentos realizados em bovinos com triturado de alecrim sem cianeto na dose de 10g/kg por 21 dias recebendo ou não exposição solar, mostraram animais normais, todavia, no exame de urina foram observadas presença de albumina e cilindros granulosos, urobilinogênio, sais biliares e modificações no pH. Os animais que receberam extrato aquoso com cianeto sofreram a cada dosagem um quadro agudo de intoxicação semelhante ao causado pelo HCN, sendo restabelecido após administração de 50ml de hipossulfito de sódio 20%, intravenosa; todavia, após esta fase, houve mortalidade. "A necropsia desses animais mostrou hemorragias no tecido subcutâneo e na musculatura esquelética, sangue de cor vermelho-escuro e incoagulável, além da presença de petéquias no epicárdio e traquiéia. Nos exames histopatológicos, observou-se distensão e rompimento dos alvéolos pulmonares, necrose centro lobular, degeneração hidrópica e turva no fígado; espessamento da cápsula de Bowman do rim, necrose tubular e presença de cilindros hialinos; hemorragias focais no miocárdio; infiltrado linfocitário perivascular e andamento do espaço de Virchow-Robin com discreta proliferação das células da glia a nível de sistema nervoso central' ' . Os demais animais mesmo recebendo ou não exposição solar permaneceram normais (¹ ).

Diante dos resultados obtidos, o presente trabalho tem por objetivo a procura do princípio ativo tóxico responsável pelo quadro de fotossensibilização do tipo hepatógeno, como é conhecido na literatura, da planta tóxica Holocalyx glaziovii.

MATERIAL E MÉTODOS

1. Pane química - As folhas de H. glaziovii foram coletadas no viveiro do Instituto Biológico de São Paulo no mês de outubro e a planta identificada no Instituto de Botânica de São Paulo. Elas, após secagem e moagem, foram extraídas e fracionadas em diversos solventes como apresenta a figura 1 e 2. A solução etanólica de 2kg de folhas foi evaporada através do rotaevaporador rotativo sob pressão reduzida e o extrato obtido estava isento de odor de HCN, confirmado por teste qualitativo com picrato de sódio. O extrato etanólico após dissolução em água, forneceu solução aquosa e um resíduo ceroso, esverdeado e insolúvel. A solução aquosa foi submetida a um fracionamento por partição, sendo extraída em seqüência com éter etflico, acetato de etila e butanol saturado em água, obtendo-se seus respectivos resíduos após evaporação dos solventes.

Os resíduos contendo componentes tóxicos foram fracionados por cromatografia em coluna de sflica gel H sob pressão e eluída com sistema de solventes: clorofórmio, metanol e água (16:9:2). As purezas das frações foram analisadas por cromatografia de camada delgada (CCD) em placas de vidro utilizando-se sflica-gel G, no mesmo sistema de solventes, e revelando-se pela exposição a vapores de amônia e de iodo, além de solução de cloreto de alumínio_10%. Os produtos puros, obtidos pelo processo acima referidos, foram identificados por análise dos dados espectroscópicos de infravemelho, ultravioleta, de massa e ressonância magnética nuclear de prótons e carbono 13.

2. Inoculações experimentais - Os resíduos: ceroso, etéro, acetato de etila, butanólico e aquoso, além dos compostos isolados, kampferitrina e prunasina, foram administrados em 5 cobaias entre 200 e 280g sob jejum, por via oral (po), nas doses de 0,20 a 0,50g/kg. Eles foram dissolvidos em 6ml de água destilada com exceção dos resíduos, etéro e ceroso, que necessitaram da adição de algumas gotas de Tween 80. As testemunhas foram inoculadas com água destilada. Em seguida, as cobaias foram mantidas em ambiente de laboratório e observadas por 24h.

Os animais mortos e os sacrifícios foram submetidos à necropsia para verificação das lesões macroscópicas e os fragmentos das diferentes vísceras, colocadas em formol 20% para exames histopatológicos. As técnicas empregadas para obtenção dos cortes foram: inclusão em parafina e coloração com hematoxilina-eosina.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

O extrato etanóiico das folhas de H. glaziovii, isenta de HCN , forneceu após fracionamento por partição os seguintes resíduos: acetato de etiIa, butanólico, etéreo e aquoso, além do resíduo ceroso, conforme figura 1 e 2. Os dois primeiros resíduos apresentaramse letais para cobaias em 90min, após administração por via oral nas doses de 0,40 e 0,50g/kg, respectivamente (Tabela 1). Contudo, os demais resíduos não mostraram toxicidade na dose de 0,50g/kg. As cobaias mostraram sintomatologia clínica de convulsão e hipernéia, antes de morrerem. Nos exames histopatológicos, tanto dos animais que morreram como naqueles que foram sacrificados, não apresentaram lesóes hepáticas ou em qualquer outro órgão. Diante dos resultados obtidos, verificou-se ausência de comprometimento hepático que desencadeia a fotossensibilização hepatógena, descrita por ROCHA E SILVA (IO), em bovino quando intoxicado por esta planta. Todavia, ocorre a presença de um ou mais composto ativo nos resíduos tóxicos que podem alterar os níveis bioquímicos normais nos animais e levando-os à morte.

TABELA 1
Efeitos tóxicos das fraçóes do estrato etanólico das folhas de H. glaziovii em cobaias.

Amostra	Dose (g/kg)
	0,20	0,30	0,40	0,50
Controle
Resíduo ceroso
Resíduo etéreo
Resíduo de acetato de etila	-	-	+	+
Residuo butanólico				+
Resíduo aquoso
Prunasina *	-	+	+	+
Kampferitrina **	-	-	-	-

O fracionamento cromatográfico em coluna de sflicagel H sob pressão do resíduo butanólico, menos tóxico que o de acetato de ettila, sendo eluída no sistema de clorofórmio, metanol e água (16:9:2) levou ao isolamento de Hg-l (0,015%), Hg-2(0,030%) e Hg-3(0,006%). Os três compostos após análise dos dados espectroscópicos foram identificados como sendo prunasina (⁴, ⁶, ¹³), um glicosídeo cianogenético (⁹) e dois flavonóides glicosídeos, a kampferitrina (⁷) (7, kampferol-3-glicose-7-ramnosídeo (IO) (⁶, ⁸, ⁹), respectivamente. Os dois primeiros foram anteriormente isolados das folhas de H. glaziovii (¹⁹), porém, não são relatados toxicidades em animais.

O composto kampferitrina, segundo a tabela 1, não indicou toxicidade para cobaias por via oral até a dose de 1 g/ kg. Todavia, a prunasina mostrou-se letal ao redor de 0,25g/ kg, nas mesmas condições, com sintomatologias idênticas dos resíduos mencionados acima.

Posteriormente, verificou-se que a cristalização do resíduo de AcOEt A ⁱ segundo figura 2, forneceu 0,19% de cristais de prunasina (Hg- 1) e pequena percentagem de kampferitrina (Hg-2), além dos mesmos serem isolados por processo cromatográfico do resíduo AcOEt A² Esses dados são indicados de maior toxicidade deste resíduo em relação ao butanólico.

Sabe-se que os glicosídeos cianogenéticos, lotauctralina e linamarina, isolados de Trifolium repens, quando administrados por via oral, mostraram-se tóxicos. A dose letal mínima de lotaustralina para ovelhas foi estimada em 4 a 5mg/kg enquanto de linamarina para ratos foi de 0,50g/kg com a ocorrência de morte dentro de 4h (¹). Da mesma maneira, a prunasina quando administrada oralmente pode ser absorvida, transportada dentro do organismo e ser metabolizada pelas enzimas intracelulares e desencadear a morte nas cobaias.

CONCLUSÕES

As frações obtidas do extrato etanólico das folhas de H. glaziovii, quando dadas por via oral em cobaias, em dose de 0,50g/kg, não apresentaram quaisquer lesões macroscópicas nem microscópicas nas suas vísceras, indicando que não houve comprometimento hepático, um quadro característico do fenômeno de fotossensibilização do tipo hepatógeno. Contudo, os resíduos de acetato de etila e, butanólico mostraram-se letais na dose aproximada de 0,40 e 0,50g/kg em 1 , 5h, ocasionando uma sintomatologia de convulsão.

O fracionamento cromatográfico dos dois resíduos tóxicos indicaram o isolamento e identificação de um glicídeo cianogenético, a prunasina, a de dois flavonóides glicosídicos, a kampferitrina e kaempferol-3-glicose-7-ramnosídeo. A substância tóxica correspondente foi a prunasina na dose letal mínima de 0,25g/kg para cobaia, por via oral.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Massayoshi Yoshida do Instituto de Química e Dr. Yoshitatsu Ichihara do Tokyo College of Pharrnacy pela obtenção de espectros de ressonância magnética nuclear de próton e carbono e de espectro de massa, respectivamente.

• *
  Trabalho realizado com auxflio financeiro do CNPq.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Fev 2025
• Data do Fascículo
  Jan-Dec 1989

Histórico

• Recebido
  03 Jul 1989