INCORPORAÇÃO E BIOTRANSFORMAÇÃO DO DDT E DO ALDRIN EM CÉLULAS IN VITRO

Incorporation and biotransfonnation of DDT and aldrin in cells in vitro.

RESUMO

O ¹⁴ C-DDT e 0 ¹⁴ C-aldrin são incorporados pelas células IB-RS-2, efeito que é diretamente proporcional ao tempo e que, após 7 horas de tratamento, atinge os valores de 25,5 e 22,1%, respectivamente. Não foram detectados metabólitos do DDT nem do aldrin no meio sobrenadante de culturas expostas aos produtos neste mesmo período; o único metabólito identificado no interior das células foi o p,p' DDE. A avaliação comparativa entre a citotoxicidade do p,p' DDE e a do p,p' DDT mostra que, após 72 horas de tratamento, o p,p' DDT inibe o crescimento celular em 34,4%, porém, induz um aumento de 1,9% na síntese de proteínas e de 0,7% no consumo de glicose; para o p,p' DDE, estes valores são de 25,0, 5,2 e O, 7%, respectivamente.

PALAVRAS-CHAVE:
DDT; aldrin; biotransformação; células in vitro.

SUMMARY

¹⁴C-DDT and ¹⁴ C-aldrin are incorporated into IB-RS-2 cells; this effect depends on the time of cells treatment and reaches respectively 25.5 and 22.1% 7 hours after cells exposure to the products. The metabolites of DDT and aldrin were not found on the medium of cells exposed to the insecticides on that same period of time; p,p' DDE was the only metabolite identified inside the cells. The comparative citotoxicity evaluation of p,p' DDT and p,p' DDE shows that p,p' DDT inhibits cell growth, protein synthesis and glucose utilization on 34.4, 1.9 and 0.7% after 72 hours of cells treatment, while p,p' DDE inhibition is of 25.0, 5.2 and 0.7%.

KEY-WORDS:
DDT; aldrin; biotransformation; cells in vitro.

INTRODUÇÃO

Os estudos sobre os mecanismos de ação de pesticidas têm se estenüdo, com particular interesse, aos seus produtos de metabolização, devido à possibilidade de os mesmos serem biologicamente mais ativos ou possufrem uma toxicidade mais acentuada do que a do produto original.

Sabe-se que, ao sofrer os processos de degradação pelos sistemas metabólicos de mamíferos, o DDT origina vários compostos, principalmente o DDA. Em muitas espécies animais, inclusive na humana, forma-se um outro metabólito, o DDE, o qual é rapidamente armazenado no tecido adiposo; o mecanismo exato desta biotransformação, entretanto, permanece desconhecido (³⁰). Pode-se também detectar nos tecidos a presença de DDD, um intermediário na formação do DDA. Além desses, numerosos outros metabólitos foram observados em várias espécies animais, mas não no homem (³⁰).

A biotransformação do aldrin em seu metabólito dieldrin, em numerosas espécies de mamfferos, foi revista por vários autores (¹⁰, ¹¹, ¹⁸). Esta transformação requer a presença de NADPH e de aldrin epoxidase, cuja atividade parece variar em função do tipo de preparação e da temperatura (⁴, ²⁰). Os dados sobre a transformação do aldrin em dieldrin não mostram diferenças qualitativas enfre as vias de degradação do produto em seres humanos e em outros mamíferos (²⁹).

Neste trabalho, foi estudada a metabolização do DDT e do aldrin em células cultivadas in vitro, sensíveis à ação destes produtos, e avaliada a citotoxicidade dos subprodutos resultantes da sua biotransformação.

MATERIAL E MÉTODOS

1 - Inseticidas - DDT (1, fenil etano); p,p'DDE (1,1 dicloro -2,2-di (4clorofenil etano); aldrin (1, 8, 9, 10, 11, 11-hexacloro-2, 3, 7, 6 - endo - 2, l, 7 - exo dimetanonaftaleno). As soluções estoque continham I Omg/ml de inseticida em etanol. ¹⁴ C-DDT (570.000 dpm/ml) e ¹⁴ C-a1drin (240.500 dpm/ml).

2 - Culturas Celulares - Monoestratos de células de linhagem suína IB-RS2, clone C-26-3, mantidos em frascos de vidro com IOOml de capacidade, conforme método já descrito (³).

3 - Avaliação da incorporação dos inseticidas nas células - Frascos contendo 4 x 10 ⁵ células eram tratados com 0,10ml de ¹⁴ CDDT e 20μg/m1 de DDT ou 0,23m1 de ¹⁴ Ca1drin e 20/.¿g/ml de aldrin. As células eram colhidas por centrifugação após 1, 3, 5 e 7 horas de exposição e, a seguir, a incorporação dos inseticidas marcados era avaliada segundo método já descrito (²).

4 - Detenninação dos produtos de metabolismo dos inseticidas - Frascos contendo 5 x 10⁶ células eram tratados com DDT ou aldrin na concentração de 20ug/ml. Após 1, 3, 5 e 7 horas, o meio sobrenadante era coletado e o "pellet" suspenso em Irnl de solução tampão fosfato pH 7, 2. A extração dos metabólitos era feita em 0,5ml do meio sobrenadante e 0,5ml do "pellet" através do método de DALE (⁷) e a identificação dos metabólitos feita por cromatografia de fase gasosa em cromatógafo CG, modelo 270, com coluna de captura eletrônica OV-173% (s/chromosorb W siliconizado).

5 - Avaliação da citotoxicidade dos produtos de metabolismo dos inseticidas - Para esta avaliação, foram usados os seguintes parâmetros:

5.1 - Influência dos produtos sobre a cinética de crescimento celtdcr - As células (3 x 10 ⁵ células/frasco) eram tratadas com p,p' DDT ou p,p' DDE na dose de 20μg/ml. A determinação do número de células era feita 24, 48 e 72 horas após a adição dos compostos em uma câmara tipo Neubauer (Resistance, Germ).

5.2 - Influência dos produtos sobre a morfologia celular - Frascos contendo 5 x 10⁶ células eram tratados com p,p' DDT ou p,p' DDE, na concentração de 20μg/ml, e a morfologia celular observada por um período de 72 horas em microscópio óptico CK Olympus.

5.3 - Influência dos produtos sobre o teor de proteínas e o consumo de glicose pelas céluIas - Frascos contendo 5 x 10⁶ células eram tratados com p,p' DDT ou p,p' DDE na concentração de 20μg/ml. Após 24, 48 e 72 horas, o "pellet" era suspenso em lml de solução tampão fosfato pH 7,2 e procedia-se à determinação do teor de proteínas pelo método do biureto (¹²). O teor de glicose presente no meio era avaliado em alíquotas do sobrenadante, coletadas nos mesmos intervalos de tempo, usando-se a reação da o - toluidina (⁶). O consumo de glicose era calculado tomandcpse por base a concentração presente no meio, antes de sua adição às culturas.

RESULTADOS

Incorporação do ¹⁴ C-DDT e ¹⁴ C-aldñn nas células - Como pode ser observado na figura 1, após a primeira hora de exposição, o DDT e o aldiin apresentam, respectivamente, uma incorporação de 7,72% e 6,30% em relação aos teores de ¹⁴ CDDT e ¹⁴ Caldrin inicialmente adicionados ao meio. Estes valores passam para 16,25% e 12,98% na terceira hora, 21,59% e 17,52% na quinta hora e 25,56% e 22, 10% na sétima hora.

FIGURA 1
Incorporação do ¹⁴ C-DDT e ¹⁴ C-AIdrin em células IB-RS-2 - As células foram semeadas (4x10 ⁵ células/frasco) e, depois de 24 horas de crescimento, incubadas com ¹⁴ C-DDT ou ¹⁴ C-aldrin. Após vários intervalos de tempo, as células foram colhidas e a determinação da radiatividade foi feita tal como indicada em Material e Métodos. Culturas tratadas com ¹⁴ C-DDT (²², ²³, ²⁴, ²⁵, ²⁶, ²⁷) e com ¹⁴ C-aldrin (²⁵)

2 - Metabólitos resultantes da transformação dos inseticidas pelas células - A figura 2.A mostra uma diminuição progessiva da concentração de DDT e de aldrin no meio sobrenadante das culturas tratadas com estes produtos.

Os resultados apresentados na figura 2B mostram que, no interior das células expostas ao DDT, foram detectados p,p' DDT, o,p' DDT e o metabólito p,p' DDE. No interior das céluIas tratadas com aldrin, foi detectado apenas aldrin. Observou-se também que há uma relação diretamente proporcional entre a concentração dos produtos e o tempo de exposição.

3 - Efeitos do p,p' DDT e p,p' DDE sobre o crescimento celular - Os resultados da figura 3 mostram que o p,p' DDT e o p,p' DDE inibem o crescimento celular, efeito que depende do tempo. Após 24 horas de exposição das células aos produtos, observa-se um nível de inibição da ordem de 16,7% e 5,6% para o p,p' DDT e p,p' DDE, respectivamente. Após 48 horas, estes valores passam a 25,0% e 17,9% e, depois de 72 horas, elevam-se para 34,4% e 25,0%, respectivamente.

FIGURA 2
Metabólitos resultantes da transformação dos inseticidas pelas células - Culturas confluentes foram expostas ao DDT e aldrin na concentração de 20A/ ml. Após vários intervalos de tempo, procedeu-se à extração dos produtos presentes no meio sobrenadante e no interior das células, e à sua identificação, por cromatografia de fase gasosa. Figura 2A: produtos presentes no meio sobrenadante. Figura 2B: produtos contidos no interior das células. Legenda: p,p' DDT p,p' DDE (.......); o,p' DDT ) e aldrin (¹⁹).

FIGURA 3
Efeitos do p,p' DDT e p,p' DDE sobre o crescimento celular - As células foram semeadas (3x10 ⁵ células/frasco) e, após 24 horas, tratadas com p,p' DDT ou p,p' DDE na concentração de 20μg/ ml. A determinação do número de células foi feita em diferentes intervalos de tempo. Culturas não tratadas (-...-), culturas tratadas com p,p' DDT (²⁸) e com p,p' DDE (......)

4 - Efeitos do p,p' DDT e p,p ' DDE sobre a morfologia celular - As alterações morfológicas causadas pelo p,p' DDT e pelo p,p' DDE são semelhantes, sendo caracterizadas por uma intensa vacuolização e alta granulosidade do citoplasma. Além disso, foi observado um acentuado descolamento do lençol celular.

5 - Efeitos do p,p' DDT e p,p' DDE sobre a síntese de proteínas - Os dados da figura 4 mostram que, 24 horas após a adição dos inseticidas ao meio, a síntese de proteínas é estimulada em 3,7% pelo p,p' DDE, mas não se altera nas células tratadas com p,p' DDT. Estes valores passam a e 5,2% para o p,p' DDE e 1,4% e 1,9% para o p,p' DDT, após 48 e 72 horas, respectivamente.

FIGURA 4
Efeitos do p,p' DDT e p,p' DDE sobre a síntese de protefnas - As culturas foram tratadas com os produtos na concentração de 20μg/ml. Após vários intervalos de tempo, as células foram colhidas e procedeu-se à determinação do teor de proteínas. Culturas não tratadas (-...-); culturas tratadas com p,p' DDT (⁸) e com p,p' DDE (.........).

6 - Efeitos do p,p' DDT e p,p'DDE sobre o consumo de glicose - Os resultados apresentados na figura 5 mostram que o consumo de glicose pelas células, após 24 horas de tratamento com p,p' DDT e p,p' DDE, é estimulado em 6,3% e 1,1%, respectivamente. Após 48 horas, estes valores passam a 6,2% e 4,4%; ao final de 72 horas, este valor é de 0,7% tanto para o p,p' DDT, como para o p,p' DDE.

DISCUSSÃO

As células da linhagem suína IB-RS-2 têm sido utilizadas no estudo do mecanismo de ação, do metabolismo e da toxicidade de vários compostos (¹⁸, ³⁰). Em trabalho anterior, demonstrou-se que o DDT e o aldrin inibem o crescimento celular e induzem uma diminuição dos teores de proteínas, RNA e DNA, e que os efeitos do DDT são mais acentuados que os induzidos pelo aldrin (⁵, ¹⁷). Os resultados do presente trabalho mostram que o DDT e o aldrin são incorporados peIas células, atingindo, na primeira hora de exposição, os níveis de 7,6% e 6,3%, respectivamente (Fig. 1). Ao estudarem a incorporação de vários inseticidas em células de embrião humano in vitro, MURAKAMI e FUKAMI (¹⁷) observaram que a incorporação inicial do DDT e do aldrin é de aproximadamente 10%. Os autores ressaltam que a incorporação destes inseticidas, reconhecidamente persistentes e estáveis no meio ambiente, é de vinte a trinta vezes maior que a do clordimeform e do paration, pesticidas considerados como não-persistentes. Experimentos realizados em animais in vivo mostraram que a incorporação de ¹⁴ C-aldrin e de ¹⁴ C dieldrin em tecido cartilaginoso é lenta, mas persistente (¹). Ao analisarem o metabolismo do DDT em pombos, SIDRA & WALKER (⁷) administraram, por via intraperitoneal, 3238mg]kg de ¹⁴ C-DDT e verificaram que, ao final de 77 dias, a incorporação do produto atingia 87% da dose administrada.

FIGURA 5
Efeitos do p,p' DDT e p,p' DDE sobre o consumo de glicose - Culturas celulares (5x10⁶ células/frasco) foram tratadas com os produtos na concentração de 20ag/ml. A determinação do consumo de glicose pelas células foi feita em diferentes intervalos de tempo. Culturas não tratadas (-...-); culturas tratadas com p,p' DDT (¹⁶) e com p,p' DDE (......)

Nossos resultados mostram, também, que a incorporação do DDT e do aldrin aumenta com o tempo de exposição. Ao avaliarem a toxicidade do aldrin em células Hel-A, DE VORE et alii (¹⁵, ²⁹) verificaram que a incorporação de ¹⁴ C-aldrin atingia o máximo 1 5 minutos após o início do tratamento. Este efeito é dependente da dose e foi correlacionado com a inibição simultânea que o aldrin induz sobre a incorporação de aminoácidos. É provável que a observação do pico dê incorporação, em menos tempo do que em nossos experimentos, possa ser atribuído à concentração mais elevada (302,0μg/ml) usada por estes autores.

Os resultados apresentados na figura 2A mostram que o teor do DDT e de aldrin no meio de cultivo diminui com o tempo, o que indica a sua penetração no interior das células, dados que estão de acordo com os resultados ob tidos com a incorporação dos inseticidas marcados com ¹⁴ C. Porém, como mostra ainda a figura 2A, embora o DDT e o aldrin penetrem rapidamente no interior das células, nenhum de seus metabólitos foi detectado no meio de cultivo. Supondo que poderiam estar ocorrendo transformações no interior das células, mas que os metabólitos delas resultantes não fossem liberados, foram realizadas as avaliações nos extratos celulares. Estes experimentos mostraram que a penetração do DDT e do aldrin é proporcional ao tempo, o que está de acordo com a diminuição progressiva da concentração dos produtos no meio, e que o p,p' DDT é degradado a p,p' DDE (Fig. 2B). Não foi detectada a presença de o,p' DDE, talvez porque a amostra utilizada contivesse apenas traços de o,p' DDT. Admite-se que as reações metabólicas são as mesmas para os isômeros o,p' e p,p' DDT; entretanto, o metabólito p,p' DDE é o mais estável no meio ambiente e é muito mais retido nos tecidos do que o DDT ou outro metabólito (²¹). Não foi detectada, também, a presença de qualquer metabólito do aldrin no interior das células (Fig. 2B). Admite-se que a transformação do aldrin em subprodutos, como o dieldrin, ocorre, principalmente, no fígado, e requer a presença de NADPH e da enzima aldrin-epoxidase (¹³). Autores como MEFENDALE et alii (⁵) mostraram que a transformação de aldrin em dieldrin também ocorre em tecidos de pulmão de coelho; o dieldrin foi' detectado depois de três minutos de exposição dos animais ao aldrin. Em relação ao nosso sistema, parece que o fato de não ter sido observada a presença de qualquer metabólito do aldrin não resulta de problemas de ordem técnica, já que o método de DALE (⁹) é altamente sensível; pode-se supor que estes resultados refletem a falta de sistemas enzimáticos necessários à transformação do aldrin.

Os resultados apresentados na figura 2 mostram que a citotoxicidade do DDT é mais acentuada do que a do DDE. Resultados semelhantes foram obtidos por MAHR & MILTENBURGER (¹⁴) ao estudarem os efeitos do DDT e seus derivados em células CHO, cultivadas in vitro. Estes autores verificaram que, em diferentes concentrações e períodos de tratamento, o DDT e o DDD inibem acentuadamente a velocidade de crescimento celular, enquanto que o DDE exerce uma ação muito mais discreta e o DDA é menos tóxico ainda. Os efeitos citogenéticos também São diferentes: o DDA é o composto que provoca menos alterações, enquanto que o DDE é mais ativo e o DDT e o DDD exercem os efeitos mais acentuados. E importante acrescentar que tanto o isômero p,p' DDT como o metabólito p,p' DDE podem causar, em ratos, efeitos teratogênicos, mutagênicos e carcinogênicos (²). PALMER et alii (²) observaram que, em células de mamíferos cultivadas in vitro, o p,p' DDT, o p,p' DDE e o p,p' DDD causam anomalias cromossômicas, e que os isômeros o,p' possuem quase a metade da atividade dos isômeros p,p'.

Nossas observações mostram que tanto o p,p' DDT como o p,p' DDE modificaram acentuadamente a morfologia celular. Autores como KIMBROUGH et alü (13), ao analisarem ao microscópio hepatócitos de ratos tratados com DDT nas concentrações de 250 ppm e 500 ppm, verificaram que as células mostravam um aumento de volume, vacuolização do citoplasma e inclusões lipídicas. Ao microscópio eletrônico, foram observados, ainda, um aumento do sistema retículo endotelial e a presença de mitocôndrias atípicas.

Nossos experimentos mostram ainda que o p,p' DDE determina um aumento do teor de proteínas celulares, efeito que atinge um pico após 48 horas de tratamento, decaindo a seguir. O p,p' DDT não altera o teor de proteínas celulares, até 24 horas após sua administração; depois deste período, ocorre um ligeiro aumento em relação às culturas usadas como controle. Não há, aparentemente, uma correlação entre o aumento observado e a ação dos produtos sobre o crescimento celular, pois os estudos iniciais mostraram que tanto o p,p' DDE como o p,p' DDT inibem a multiplicação celular. Deve-se, entretanto, observar que, nestas avaliações iniciais, foram usadas células na fase exponencial de crescimento, de maneira que o efeito reflete diretamente a ação dos produtos sobre o número de células. Entretanto, ao ser avaliada a ação do p,p' DDE e do p,p' DDT sobre a síntese de proteínas, foram usadas culturas confluentes, ficando, portanto, eliminado o efeito sobre o número de células. Autores como CHUNG et alii (5), estudando a ação do DDT em células HeLa, fizeram observações semelhantes, e atribuem a ausência de correlação entre os dois efeitos a um aumento do volume das células.

Em relação ao consumo de glicose, observou-se que tanto o p,p' DDT como o p,p' DDE induzem um aumento da sua utilização pelas células, o que está de acordo com o aumento da atividade de sfntese protéica observada. Sabe-se que os organoclorados atuam sobre o metabolismo de carboidratos, ação cujo mecanismo não está bem-esclarecido, mas que tem sido correlacionado com os efeitos destes compostos sobre as enzimas hepáticas envolvidas na produção, armazenagem e metabolismo da glicose (4, 16, 10. DUDEJA et alii (9) verificaram que a administração de uma única dose de DDT a macacos Rheg¿s provoca um aumento acentuado nos teores de glicogênio hepático, embora não te. nha sido observada qualquer alteração nos níveis de glicose no sangue. Ao estudarem os efeitos da exposição prolongada de macacos Rhesus ao DDT, MAHMOOD et alii (14) verificaram que há um aumento da incorporação de d-glicose nos enterócitos e correlacionaram este efeito com alterações na organização estrutural da membrana celular, induzidas pelo inseticida.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Fev 2025
• Data do Fascículo
  Jan-Dec 1985

Histórico

• Recebido
  25 Maio 1984