INFECÇÃO CAUSADA POR NUCLEOPOLYHEDROVIRUS NAS CÉLULAS GORDUROSAS DE BOMBYX MORI L., 1758 (LEPIDOPTERA: BOMBYCIDAE)*RESUMO
Nucleopolyhedrovirus isolado de lagartas de Bombyx mori (BmNPV) no estado do Paraná, e identificado através de técnicas microscópicas específicas e análises sintomatológicas, foi utilizado na infecção de lagartas sadias de B. mori. Em diferentes tempos pós-inoculação as lagartas foram anestesiadas, dissecadas, o tecido gorduroso foi retirado e fixado em DuBosq Brasil. Posteriormente, o material foi corado pela técnica de Azan modificado, e processado segundo as etapas convencionais para preparados histológicos. Os primeiros sinais da infecção pelo BmNPV ocorreram no 4º dia pós-inoculação e as análises cito e histopatológicas do tecido gorduroso revelaram que este vírus apresenta uma replicação assincrônica. Nos núcleos de células gordurosas infectadas pôdese visualizar as diferentes fases do ciclo reprodutivo viral: inicialmente o núcleo hipertrofia, com a formação do estroma virogênico, local onde os vírions são produzidos; segue-se a oclusão dos vírions em um cristal protéico, o poliedro; no final do ciclo infeccioso, os poliedros são liberados para a hemolinfa devido a lise celular. Lagartas controle foram processadas da mesma maneira que o material inoculado com o BmNPV, e não apresentaram nenhum sinal de infecção.
PALAVRAS-CHAVE:
Bombyx mori; tecido gorduroso; Nucleopolyhedrovirus; citopatologia; histopatologia.
ABSTRACT
Nucleopolyhedrovirus isolate from infected Bombyx mori larvae (BmNPV) in Paraná State was used to inoculate healthy fifth-instar larvae. Samples of adipose tissue were removed from the experimental animals at different times, and processed for light microscopy by routine techniques. The samples included both inoculated and non-inoculated larvae (control). Azan staining of sections of infected tissue revealed in the inoculated material different stages in the pathology, indicating the asynchronous replication of the BmNPV. The infection of adipose cells could be detected as early as at the fourth day after inoculation. Initially, it is characterized by nuclear hypertrophy and the presence of virogenic stroma, where the virions are produced. In a second stage, the virions appear occluded into protein crystals, the polyhedra. In a more advanced stage of viral replication, the cells undergo lysis and liberate a great number of polyhedra into the general cavity of the insect body. The control material did not present any signs of infection.
KEY WORDS:
Bombyx mori; adipose tissue; Nucleopolyhedrovirus; pathology.
INTRODUÇÃO
Os Nucleopolyhedrovirus (NPV) representam um gênero de vírus entomopatogênicos, pertencentes à família Baculoviridae (MURPHY et al., 1995). Infectam, predominantemente, insetos holometábolos, particularmente os da ordem Lepidoptera (SENGUPTA et al., 1990; BILIMORIA, 1991). No Brasil, estes vírus são muito utilizados em programas de controle biológico, onde suas características patogênicas são exploradas para a eliminação de insetos pragas, como no caso de Anticarsia gemmatalis. Contudo, sua ocorrência em insetos úteis, como no bicho-da-seda da amoreira (Bombyx mori), é extremamente danosa para a produção de seda, representando mundialmente um sério problema para a sericicultura (FONSECA & FONSECA, 1986; SENGUPTA et al., 1990).
Os Nucleopolyhedrovirus caracterizam-se por serem poliorganotróficos (GRANADOS & WILLIAMS, 1986; SENGUPTA et al., 1990; BILIMORIA, 1991) e a principal via de entrada é a oral, pela ingestão de alimento contaminado. As folhas da amoreira, alimento do bicho-daseda, são digeridas e absorvidas no intestino médio (CHAPMAN, 1998) e os vírus, porventura presentes nestas folhas, penetram nas células epiteliais do tubo digestivo (GRANADOS & LAWLER, 1981), alcançam a hemolinfa, e vão contaminar outras células do corpo do inseto (STOLTZ et al., 1973; VOLKMAN & SUMMERS, 1977; GRANADOS & WILLIAMS, 1986; ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BRANCALHÃO, 1998). As células gordurosas são alvos preferenciais na infecção pelo Nucleopolyhedrovirus (BENZ, 1986; BILIMORIA, 1991); possivelmente devido as suas funções no metabolismo intermediário e no armazenamento de nutrientes (CHAPMAN, 1998), representando um local rico em substratos e energia necessários à replicação viral.
No Brasil, particularmente o estado do Paraná, responsável por 83,59% da produção nacional de seda (WATANABE et al., 2000), poucos são os trabalhos sobre Nucleopolyhedrovirus nas lagartas de B. mori (BRANCALHÃO, 1998). Assim, o presente estudo teve como objetivos: verificar a ocorrência de Nucleopolyhedrovirus na sericicultura paranaense; utilizar o isolado geográfico do NPV para analisar a cito e histopatologia da infecção e verificar o tempo de infecção no tecido gorduroso do bicho-da-seda da amoreira.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas lagartas híbridas do bicho-daseda da amoreira, Bombyx mori, de 5°° estádio1, sadias e com suspeita de infecção viral. O material suspeito incluiu lagartas originalmente coletadas doentes e mortas. Em laboratório, as lagartas suspeitas de infecção foram armazenadas a temperatura de -4°C.
As coletas foram realizadas diretamente nos barracões de criação de produtores rurais do estado do Paraná. As regiões de coleta foram a Norte, municípios de Nova Esperança, Maringá e Umuarama, região Oeste, municípios de Cascavel e Matelândia, e região Sul, município de Cerro Azul. As coletas foram efetuadas bimensalmente, nos anos de 1994, 1995, 1998 e 2000. Nos meses de junho e julho não foram feitas coletas porque, sendo meses frios, não há produção de lagartas.
Para a pré-identificação do agente infeccioso as lagartas suspeitas foram maceradas em água destilada, sendo o macerado filtrado em algodão. Este foi observado ao microscópio de luz para a verificação da presença ou não de corpos de oclusão de origem viral, através de preparações rápidas, a fresco e corados pelo Azocarmin G (BRANCALHÃO, 2000).
Confirmada a presença dos corpos de oclusão, este macerado foi centrifugado por três vezes a 2.000 rpm em microcentrífuga por 10 minutos, sendo descartados os sobrenadantes e o material restante ressuspendido em água destilada a cada centrifugação. Após este tempo, os corpos de oclusão foram recolhidos, colocados em frascos esterilizados e armazenados a --10°°C até o momento de usar. O material resultante desta semipurificação, denominado inóculo, foi pulverizado sobre folhas de amoreira a uma concentração de 2,26 x 106 COP/ml (COP= corpos de oclusão poliédricos), e estas folhas fornecidas na alimentação de lagartas sadias do 5°° estádio.
Os sintomas manifestados pelas lagartas doentes foram observados e anotados diariamente, em fichas próprias. Os dados foram comparados com os sintomas da doença causada por Nucleopolyhedrovirus descritos em literatura (GRANADOS & WILLIAMS, 1986; HANADA & WATANABE, 1986; FONSECA & FONSECA, 1986; SENGUPTA et al., 1990; ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BRANCALHÃO, 1998).
Em diferentes tempos pós-inoculação (durante oito dias com intervalos de vinte e quatro horas) as lagartas foram anestesiadas com éter etílico e dissecadas sobre placas de Petri com parafina solidificada. Tais tempos foram necessários porque não se conhecia ao certo o caminho do patógeno pelo tubo digestivo até as células alvo, e o tempo em que estes vírus iniciam a infecção. As lagartas foram colocadas em posição ventral, fixadas com alfinetes entomológicos (na cabeça e falsas pernas caudais), e com uma tesoura de ponta fina foram abertas longitudinalmente, desde a região anal até a altura da cabeça. O fixador, DuBosq Brasil (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1983), foi gotejado continuamente durante o processo de abertura do tegumento. O tegumento aberto foi preso na placa com os alfinetes, a glândula da seda foi retirada e as traquéias foram cortadas para liberar o intestino. O tecido gorduroso, de diferentes partes do corpo do inseto, foi rapidamente retirado e colocado em frasco rotulado contendo o fixador, por 24 horas.
Antes de iniciar a desidratação os segmentos foram deixados por 24 horas em solução 0,5% de amoníaco em álcool etílico a 70%, para a retirada do excesso de ácido pícrico do fixador. Posteriormente, o material foi passado pelas etapas convencionais dos preparados histológicos, com algumas alterações referentes aos tempos: desidratação em série crescente de soluções aquosas de álcool etílico (70%, 80%, 90%, 95% e 3 vezes em 100%) por 40 minutos cada; diafanização em álcool + xilol (na proporção de 1:1) por 40 minutos e xilol I, II, III por 15 minutos cada; banho em parafina a 60°°C, por 4 horas; emblocagem e corte, sendo que os cortes foram feitos na espessura de 4 a 5 mmm em micrótomo E. Leitz Wetzlar; desparafinização das lâminas em xilol I, II e III e hidratação na série decrescente de soluções aquosas de álcool etílico (100% por 3 vezes, 95%, 90%, 80% e 70%) por 3 minutos cada; lavagem em água corrente (10 minutos), seguida de 2 lavagens em água destilada (10 segundos cada).
As lâminas assim obtidas foram coradas pela técnica de Azan, modificada para corpos de oclusão virais, segundo HAMM (1966). Foram realizados 03 experimentos de inoculação, onde foram utilizadas 30 lagartas por experimento, sendo que as lâminas foram confeccionadas a partir de duas lagartas para cada intervalo de tempo estudado, tendo sido produzidas 20 lâminas por intervalo de tempo e 160 lâminas no total.
Lâminas controle, obtidas de lagartas sadias de 5° estádio, foram submetidas às mesmas preparações utilizadas para o material inoculado com o vírus, descritas acima. Todas as lâminas foram analisadas em um microscópio de luz Olympus CBA e fotomicrografados em fotomicroscópio Olympus CBA-K.
Fluxograma da metodologia descrita é apresentado no Esquema 1.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As análises cito e histopatológicas do tecido gorduroso revelaram a presença de corpos de oclusão de forma poliédrica, corados em vermelho (Figs. 1 e 2). Segundo a literatura estes corpos de oclusão são estruturas virais, sendo a forma poliédrica característica das famílias Baculoviridae (gênero Nucleopolyhedrovirus) e Reoviridae (Cypovirus), que infectam B. mori (ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; MURPHY et al., 1995; RIBEIRO et al., 1998).
Corte histológico do tecido gorduroso de lagartas de B. mori de 5°? estádio, no 5° dia pós-inoculação com BmNPV. Coloração: Azan modificado. Observe várias células em diferentes fases da infecção; os poliedros apresentam-se corados em vermelho no interior das células e no meio extracelular; 400 X. Em detalhe: a- núcleos hipertrofiados de duas células infectadas; a cabeça de seta aponta o estroma virogênico; b e c- núcleos hipertrofiados com os poliedros em formação, de coloração esverdeada (seta); d- núcleo hipertrofiado com os poliedros maduros (maiores, em vermelho). Envoltório nuclear (E), citoplasma (T), membrana plasmática (P); 1.000 X.
Corte histológico do tecido gorduroso de lagartas de B. mori de 5°? estádio, corado com Azan modificado; aumento de 1.000 X. Em a, 7° dia pós-inoculação com BmNPV; observar a lise celular, a grande quantidade de poliedros maduros (em vermelho), no meio intracelular e extracelular, e os restos das células gordurosas (R). Em b, material controle. Núcleo (N), citoplasma (T), membrana plasmática (P), traquéia (Tr).
Os corpos de oclusão poliédricos ou, simplesmente, poliedros foram detectados a partir do 4º dia pósinoculação, no núcleo das células gordurosas, enquanto o citoplasma permaneceu inalterado. Esta característica permite distinguir entre Nucleopolyhedrovirus e Cypovirus, pois, este multiplica-se no citoplasma celular (MURPHY et al., 1995). Poliedros nucleares em B. mori foram reconhecidos há muito tempo (BERGOLD, 1947); contudo, no Brasil só foram detectados em 1976, por GATTI et al. e em 1979, por ONGARELLI, ambos no estado de São Paulo.
Os núcleos das células gordurosas infectadas apresentavam-se hipertrofiados e em diferentes estágios da infecção, indicando uma replicação assincrônica do vírus (Fig. 1 - visão panorâmica). Nestes núcleos a primeira estrutura visível é o viroplasma ou estroma virogênico (EV), único, de formato variável e coloração verde (Fig. 1a). No EV os nucleocapsídeos não-envelopados são produzidos, posteriormente, adquirem o envelope constituindo então os vírions, não visíveis ao microscópio de luz (GRANADOS & LAWLER, 1981; FRASER, 1986; GRANADOS & WILLIAMS, 1986; ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BRANCALHÃO, 1998). Em uma fase subseqüente, o EV apresentava-se circundado por poliedros de tamanho variável (Fig. 1b, c e d). Isto representa diferentes estágios do desenvolvimento da estrutura poliédrica, que cresce pelo acúmulo e cristalização contínuos da proteína poliedrina (Blissard & Rohrmann, 1990). Em uma fase mais avançada do ciclo reprodutivo deste vírus ocorre citólise e conseqüente liberação dos poliedros já maduros na cavidade geral do corpo do inseto (Fig. 2a). Todas estas etapas são condizentes com os relatos da literatura para a replicação de Nucleopolyhedrovirus (KEDDIE & VOLKMAN, 1985; FRASER, 1986; GRANADOS & WILLIAMS, 1986; ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BRANCALHÃO, 1998).
Lâminas controle provenientes de lagartas sadias de 5°° estádio e processadas da mesma forma descrita para as infectadas, não apresentaram poliedros, nem EV, ou quaisquer estruturas ou componentes que indicassem infecção viral, em nenhum dos tempos analisados (Fig. 2b). Além dos poliedros virais, em nenhuma das lâminas foi observada a presença de protozoários, bactérias ou outros patógenos que pudessem estar associados às alterações descritas.
As observações diárias das lagartas de B. mori revelaram uma série de sintomas característicos (Tabela 1) de doença causada por Nucleopolyhedrovirus (GRANADOS & WILLIAMS, 1986; HANADA & WATANABE, 1986; FONSECA & FONSECA, 1986; SENGUPTA et al., 1990; ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BRANCALHÃO, 1998). Os primeiros sinais da doença apareceram a partir do 4° dia pós-inoculação, através de mudanças na coloração do tegumento, que passa de branco para brancoamarelado (GRANADOS & WILLIAMS, 1986; HANADA & WATANABE, 1986; BRANCALHÃO, 1998). Este tempo coincide com a infecção das células gordurosas. Estas células aparecem organizadas em lâminas que, normalmente, distribuem-se em duas camadas, uma próxima ao tegumento e a outra próxima ao intestino; formam, também, massas celulares irregulares suspensas na hemocele, ficando em contato direto com a hemolinfa. Sendo um importante centro de reações metabólicas, como o metabolismo de lipídios (CHAPMAN, 1998), a infecção destas células por Nucleopolyhedrovirus acarreta um aumento no conteúdo de fosfolipídios, colesterol e ácidos graxos livres na hemolinfa que, somado à presença dos poliedros, se torna leitosa, conferindo, assim, o aspecto branco-amarelado ao tegumento (ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BRANCALHÃO, 1998).
Sintomas manifestados pelas lagartas de B. mori de 5° estádio infectadas por Nucleopolyhedrovirus.
A alteração na coloração do tegumento acentua-se com a evolução da doença, uma vez que aumenta o número de células gordurosas infectadas; somada à contribuição de outros tecidos infectados no corpo do inseto, que também são lisados (BRANCALHÃO, 1998). Freqüentemente, ocorre a ruptura do tegumento, levando ao extravasamento da hemolinfa rica em poliedros maduros. Também foi verificada a eliminação de poliedros pela boca, através da regurgitação, e pelo ânus, fato igualmente descrito por LONGWORTH & KALMAKOFF, (1982), ENTWISTLE et al. (1983) e VASCONCELOS (1996).
Os poliedros são estruturas de resistência do vírus que persistem por longo tempo no meio ambiente (DAVID, 1975; CIANCIARULLO et al., 1977; LEWIS & ROLLINSON, 1978; LONGWORTH & KALMAKOFF, 1982; BLISSARD & ROHRMANN, 1990; ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BILIMORIA, 1991). O isolado geográfico do BmNPV obtido neste experimento apresenta alta virulência, o que se comprovou pelo curto intervalo de tempo lque passou desde a inoculação até o início das mortes das lagartas, já a partir do 5°° pós-inoculação e, pela morte de 80% das lagartas ao final dos experimentos. As 20% restantes construíram casulos de baixa qualidade e, em sua maioria, morreram na fase de pupa.
As lagartas infectadas com BmNPV representam um foco potencial de vírus, e dada a quantidade surpreendente de poliedros produzidos (GRANADOS & WILLIAMS, 1986; SENGUPTA et al., 1990; ADAMS & MCCLINTOCK, 1991; BILIMORIA, 1991), medidas profiláticas são de suma importância para evitar a transmissão e a dispersão da doença nos barracões de criação de B. mori e no amoreiral (meio ambiente). Segundo HANADA & WATANABE (1986), uma vez doentes, as lagartas não se curam. A eliminação de corpos de oclusão infectivos através da boca, do ânus e do tegumento rompido, sobre as folhas da amoreira e nos barracões de criação, permite sua ingestão por lagartas sadias; e uma vez que a via oral é a principal via de entrada dos NPV (LONGWORTH & KALMAKOFF, 1982; SENGUPTA et al., 1990; VASCONCELOS, 1996), estes podem reiniciar seu processo infeccioso no novo hospedeiro. Some-se a isto o deslocamento aleatório e o geotropismo negativo exibidos pelas lagartas infectadas, alterações comportamentais comuns nas infecções pelo baculovírus, o que contribui ainda mais para a dispersão da doença dentro dos barracões de criação (GRANADOS & WILLIAMS, 1986; HANADA & WATANABE, 1986; BRANCALHÃO, 1998).
Assim sendo, ao ser detectada a presença destes vírus no barracão de criação do bicho-da-seda, deve ser imediatamente interrompida a prática de utilizar os resíduos de criação do bicho-da-seda como adubo nas plantações de amoreira. Uma vez que os vírus podem permanecer no solo, alcançarem e permanecerem aderidos às folhas e caules (LONGWORTH & KALMAKOFF, 1982; CIANCIARULLO et al., 1977; VASCONCELOS, 1996) da amoreira, tanto através das chuvas, como pela forma de adubação, isto colabora para a dispersão viral no amoreiral, que pode vir a ser reintroduzido nos barracões de criação, e ser ingerido pelas lagartas das próximas criações de bicho-da-seda.
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Testes preliminares, visando determinar o estádio a ser estudado, foram efetuados em laboratório com lagartas do 1°°, 2°°, 3°°, 4°° e 5°° estádios. O 5°° estádio foi utilizado neste estudo por apresentar um tamanho mais adequado ao manuseio, por ser mais resistente e por permitir o fácil acompanhamento da sintomatologia da doença.
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