INCLUSÕES CITOPLASMÁTICA EM PLANTAS DE DATURA STRAMONIUM INOCULADAS COM DIFERENTES ISOLADOS DO VIRUS DO MOSAICO DA BERINJELA (TYMOVÍRUS)RESUMO
Quatro isolados do virus do mosaico da beringela - EMV (grupo Tymovfrus) foram estudados quanto indugäo de inclusöes citoplasmåticas visiveis ao microsc6pio 6ptico. Com esta finalidade, células epidérmicas da nervura abaxial de folhas foram coradas através de diferentes procedimentos, visando evidenciar as inclusöes. Investigou-se o efeito da temperatura (ITC, 22°C e 27°C) sobre a indugäo de inclusöes pelos quatro isolados do EMV. A temperatura de ITC retardou em cerca de 7 dias o apareecimento de tais estruturas, quando comparada com os tratamentos a 22°C e a 2TC. Concluiu-se que, em todos os casos, é possfvel detectar inclusöes amorfas, constitufdas de um aglomerado de cloroplastos degenerados, nas proximidades do nücleo. Portanto, a técnica empregada, embora näo seja adequada para a separagäo dos quatro isolados, é de grande valor na caracterizagäo do virus (EMV), pois os corpos de inclusäo citoplasmåticos säo sempre induzidos, nas diferentes condigöes consideradas neste trabalho.
PALAVRAS-CHAVE:
Corpos de inclusäo; Datura stramonium; virus do mosaico da berinjela.
SUMMARY
The induction of citoplasmic inclusion bodies was studied under light microscopy in four isolates of eggplant mosaic virus - EMV (Tymovirus group). Several staining methods were used to show the inclusion bodies present in the epidermis covering the abaxial surface of vein leaves. Temperature effect (ITC, 22°C and 27°C) on the inclusion bodies induction was evaluated for the 4 EMV isolates. Comparing the treatments carried out at ITC, 22°C and 27°C the formation of inclusion bodies was delayed almost 7 days at ITC. Results led to the conclusion that all treatments induce amorphous inclusions, which are composed of degenerated clumped chloroplast near the nuclei. The technique used is valuable for EMV characterization, since cytoplasmic inclusion bodies are always induced under the various conditions considered in this work.
KEY-WORDS:
Inclusion bodies; Datura stramonium; eggplant mosaic virus.
INTRODUÇÃO
Os Tymovfrus constituem um grupo de fitovfrus isométricos (25-30nm de diåmetro), bastante eståveis, que atingem elevada concentragäo nas hospedeiras. Säo facilmente transmitidos por inoculagäo mecånica e, na natureza, transmitem-se por cole6pteros. Tém sido revisados por diversos autores (16, 17, 20, 21) e, entre suas caracterfsticas mais importantes, destaca-se a indugäo de alteragöes celulares, a nivel dos cloroplastos, formando inclusöes citoplasmåticas amorfas, visfveis ao microsc6pio 6ptico (11, 16, 17).
De acordo com a literatura, os Tymovirus tém ampla distribuigäo geogråfica, tendo sido detectados em vårios pafses. Entretanto, nenhum virus deste grupo havia sido constatado no Brasil, até 1983. Em outros pafses da América do Sul, jå foram detectados o virus latente da batata andina ("Andean potato latent virus" - APLV), nas regiöes andinas da Bolivia, Colömbia, Equador e Peru, e o vírus do mosaico da berinjela ("eggplant mosaic virus" - EMV), na Ilha de Trindade e na Venezuela. No Brasil, o vírus da necrose branca do tomateiro - VNBT, um vírus encontrado em tomateiros - Lycopersicon esculentum Mill. - da região de Itaquaquecetuba-SP, em 1975, por técnicos do Instituto Biológico (7), apenas em 1983 foi adequadamente caracterizado como um Tymovírus (2). Mostrou-se que não se trata de um vírus novo, mas de um isolado do EMV, diferente de outros já conhecidos e, assim, pela primeira vez, o grupo Tymovírus foi relatado no país.
Considerando a importância dos corpos de inclusão na caracterização de vírus deste grupo (11), resolveu-se realizar um estudo comparativo entre 4 isolados do EMV - incluindo o VNBT - visando fornecer subsídios a sua identificação, através da microscopia óptica, e também comparar os efeitos da temperatura sobre a formação das inclusões.
MATERIAL E MÉTODOS
A relação dos tymovírus utilizados, quatro isolados do vírus do mosaico da berinjela (EMV = "eggplant mosaic virus"), encontra-se no quadro 1.
Foram empregadas plantas de Datura stramonium L. - Solanácea - com idade de 25-30 dias, no estádio de 3 a 4 folhas, excluídos os cotilédones. Foi inoculada uma folha por planta (sempre a 3.a, que correspondia à mais jovem bem desenvolvida). O inóculo foi preparado em tampão fosfato 0,02M, pH 7,0 -H sulfito de sódio 0,5%, a partir de folhas de plantas de D. stramonium sistemicamente infectadas pelos vírus.
Como controle, utilizaram-se daturas da mesma idade, cujas folhas foram friccionadas apenas com o tampão.
As plantas foram submetidas a condições controladas de luz e temperatura, em estufa incubadora FANEM. O fotoperíodo foi mantido constante (20h luz) e as temperaturas usadas foram 17°C, 22°C e 27°C. Procurou-se manter um nível adequado de unidade na câmara, através da colocação de recipientes com água.
Para o estudo das inclusões, a metodologia consistiu em retirar, cuidadosamente, com o auxílio de uma pinça, películas epidérmicas da nervura principal das folhas, na face inferior, tendo sido examinadas várias folhas por planta. A seguir, o material foi corado com solução de floxina 1% em éter monometílico de etileno glicol ("cellosolve") + álcool etílico 95% + água destilada, nas proporções 2: 1: 1, durante 15 minutos (5, 8, 9).
Além desta técnica, o material foi submetido à coloração com "azure" ou "calcomine orange" + "luxol brilliant green" na proporção 4:1 (8, 9). Após a coloração, as películas foram lavadas em água corrente, e montadas entre lâmina e lamínula, com glicerina 67%. As observações foram realizadas em microscópio Zeiss, modelo 18 Standard, e a formação das inclusões pôde ser acompanhada através de desenhos feitos à câmara-clara e fotografias.
As plantas (6 por tratamento) foram mantidas na estufa incubadora por um período de apenas 30 dias, período este suficiente para as constatações que se pretendia fazer.
As condições a que as plantas foram submetidas basearam-se em conhecimento prévio sobre a melhor temperatura para a replicação do VNBT (2, 10) e, o fotoperíodo utilizado, em experimento sobre a morfogênese de inclusões em plantas de pimenta, induzidas pelo vírus do mosaico do pepino (23).
RESULTADOS
Os resultados, expressos na tabela 1, mostram que os quatro isolados provocaram sintoma local (L) e sistêmico (S) em plantas de Datura stramonium. Além disso, sempre induziram inclusões citoplasmáticas amorfas, próximas ao núcleo, constituídas de cloroplastos degenerados. Tais inclusões foram formadas nas três temperaturas (17ºC, 22ºC e 27ºC), porém só puderam ser observadas após o aparecimento dos sintomas sistêmicos. Verifica-se, também, que a temperatura de 17ºC retardou tanto o aparecimento dos sintomas como dos corpos de inclusão e que, a 22ºC, os sintomas locais e sistêmicos surgiram simultaneamente.
Tempo necessário para o aparecimento dos sintomas e para a indução de inclusões em D. stramonium, em diferentes temperaturas (dias após a inoculação).
Células da epiderme foliar de planta de D. stramonium inoculada com o VNBT. Coloração: floxina 1% em "cellosolve" + álcool etílico 95 o/0+ água destilada. Lâmina preparada aos 20 dias após a inoculação. Nota-se, na maioria das células, um corpo de inclusão amorfo, nas proximidades do núcleo. (Aumento: 160 x)
A figura 1 mostra algumas inclusões em células epidérmicas de D. stramonium. Nota-se que há um único corpo de inclusão por célula, localizado nas proximidades do núcleo. A figura 2 corresponde ao controle: os cloroplastos situam-se na periferia das células, e não há inclusões.
Com relação às técnicas de coloração usadas, todas permitiram a detecção de inclusões. Entretanto, as melhores preparações foram obtidas com o emprego de floxina, como descrito em Material e Métodos.
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
A detecção de inclusões celulares, em plantas infectadas por vírus, tem sido um caráter auxiliar na classificação e na diagnose destes patógenos (6, 9, 11).
O aparecimento de inclusão citoplasmática amorfa, do tipo analisado neste trabalho - constituída de cloroplastos degenerados, agrupados nas proximidades do núCleo - é um caráter com valor diagnóstico para os vírus do grupo Tymovírus (16, 17, 18, 22, 24, 25). Dentre os Tymovírus, têm sido melhor estudados, quanto às inclusões, o mosaico amarelo do nabo ("turnip yellow mosaic virus" - TYMV), o mosqueado da beladona ("belladona mottle vlrus• "-BMV) e o mosaico do pepino selvagem ("wild cucumber mosaic virus" - WCMV), através de microscopia óptica (1, 22, 24, 25). Com relação ao EMV, há poucas observações publicadas (14, 15).
Células da epiderme foliar de planta-controle de D. stramonium. Coloração: floxina 1% em "cellosolve" + álcool etílico 95% + água destilada. Observam-se os cloroplastos, na periferia das células. (Aumento: 100 x)
BARRADAS, em 1983 (2), estudando o vírus da necrose branca do tomateiro, conseguiu classificá-lo como um Tymovírus, através de diferentes evidências, baseadas em características biológicas, físico-químicas, bioquímicas e sorológicas. Constatou a formação de corpos de inclusão amorfos, no citoplasma, compostos de um aglomerado de cloroplastos desorganizados (2), tendo estudado, também, a sua ultraestrutura (4). Estas observações foram realizadas em plantas de D. stramonium mantidas em casa-devegetação, nas condições ambientais.
Os resultados apresentados no presente trabalho deixam claro que tais estruturas podem ser induzidas, também, em condições controladas de luz e temperatura constante e que o fatcr temperatura influencia seu tempo de aparecimento. Assim, são formadas mais rapidamente a 22°C e a 27oc que a 17°C. MOORMAN & WOODBRIDGE, em 1983 (23), realizaram um estudo sobre o vírus do mosaico do pepino, em plantas de pimenta, e mostraram que a temperatura age sobre a morfologia e o tempo gasto para a formação dos corpos de inclusão, que, neste caso, são cristais.
De acordo com os dados mostrados na tabela 1, parece haver uma relação direta entre o surgimento dos sintomas sistêmicos e a detecção destas estruturas, pois não se consegue observá-las antes do aparecimento dos sintomas.
Não foram encontradas diferenças entre as inclusões induzidas pelos quatro isolados do EMV (EMV-AI, EMV-Sc, EMV-ts e VNBT), quanto à morfologia observada à microscopia óptica, e nem quanto ao tempo de aparecimento. Tais resultados confirmam o estreito parentesco entre estes isolados, já demonstrado através de provas sorológicas (2, 3).
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