DOSEAMENTO DA ATIVIDADE DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDRODROGENASE EM CÉLULAS IN VITRORESUMO
A atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase em células in vitro foi determinada através de método espectrofotométrico. Foi estabelecida a densidade populacional adequada e padronizaram-se as condições para extração da enzima e para o desenvolvimento da reação.
PALAVRAS-CHAVE:
Glicose-6-fosfato desidrogenase; células in vitro.
SUMMARY
The activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase in cells in vitro was evaluated spectrophotometrically. The adequate cell density and conditions for enzyme extraction and assay were established.
KEY-WORDS:
Glucose-6-phosphate dehydrogenase; cells in vitro.
O doseamento de enzimas em células cultivadas é usado tanto como parâmetro para a avaliação de dano celular como medida de alterações metabólicas (1, 5, 6, 7, 8).
Uma das maiores dificuldades encontradas nestas determinações é a necessidade de se adequar a metodologia, que geralmente é estabelecida para doseamentos em órgãos, tecidos e fluídos retirados de animais. Os pontos críticos nestas determinações são o número' de células, os tampões para extração e as condições de preservação da atividade enzimática. O doseamento da glicose-6-fosfato desidrogenade (G-6-PDH) em células de rim suíno IB-RS-2 foi estabelecido em nosso laboratório, segundo o protocolo descrito a seguir.
A - Extração da enzima - São utilizadas aproximadamente 42x166 célula (6x 106 células/frasco de vidro com 40cm2 de área útil). Cada frasco é lavado três vezes, com 3ml de solução fisiológica; a seguir, as células são descoladas com um bastão de vidro, suspensas em lml da mesma solução e colhidas por centrifugação sob refrigeração a 2.500rpm, por 5 minutos. A seguir, o "pellet" é lavado com 10m1 de tampão TNM pH 7,8 (0,01M Tris, 0,01M NaC1 e 0,0015M MgC12), ressuspenso em 0,5ml de TNM e mantido por 10 minutos em gelo. As células são homogeneizadas 10 vezes em homogeneizador tipo Dounce e centrifugadas a 2.500rpm, por 5 minutos. O sobrenadante é colhido e mantido em gelo; o "pellet" é novamente suspenso em 0,5ml de TNM e separado por centrifugação; combinam-se os dois sobrenadantes.
B - Doseamento da atividade enzimática - A atividade é determinada pela medida da absorbância a 340nm nos primeiros cinco minutos de reação, em espectrofotômetro Beckman modelo DBG acoplado a banho-maria com termo regulador ajustado para 30°C (2, 6). As condições do ensaio são as seguintes: 2,4ml de tampão TNM, pH 7,8, o,2m1 de MgC12 0,1M, o,lml NADP 12mM e 0,2ml da preparação enzimática. A reação é iniciada pela adição de 0,1ml de glicose-6-fosfato 0,03M; ao branco não é adicionado NADP.
Sob as condições estabelecidas, a reação é linear (Fig. 1) e a sua velocidade é dependente da concentração de células na amostra. O pH ótimo para a extração da enzima e desenvolvimento da reação é 7,8, ocorrendo uma ligeira queda da atividade em pH mais alcalinos. A cinética da reação é semelhante à observada no doseamento da enzima em órgãos e tecidos de animais (8).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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